一种产碱杆菌菌株及其驯化纯化方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种产碱杆菌菌株及其驯化纯化方法和应用。该产碱杆菌菌株的名称为产碱杆菌CJ01，保藏编号为CCTCC NO：M 2017571，该产碱杆菌菌株的驯化纯化方法包括采样、分离土著微生物、第一轮驯化、第二轮驯化、第三轮驯化、纯化和保藏。该产碱杆菌菌株可应用于降解2,2’,4,4’‑四溴联苯醚，实现降解效率高，降解产物对环境友好的优点，克服现有厌氧微生物降解2,2’,4,4’‑四溴联苯醚技术的不足。

Alcaligenes strain and its domestication and purification method and Application

The invention discloses an Alcaligenes strain and its domestication and purification method and application. The name of the strain was CJ01, and the preservation was CCTCC NO:M 2017571. The methods of acclimation and purification of the bacilli strain include sampling, isolation of indigenous microbes, first round acclimation, second round domestication, third round domestication, purification and preservation. This strain can be applied to the degradation of 2,2 ', 4,4' and four brominated diphenyl ethers. The degradation efficiency is high, the degradation product is environmentally friendly, and the deficiency of the existing anaerobic microorganism to degrade 2,2 'and 4,4' four brominated diphenyl ether is overcome.

【技术实现步骤摘要】
一种产碱杆菌菌株及其驯化纯化方法和应用
本专利技术属于有机污染物降解领域，涉及一种厌氧微生物及其筛选纯化方法和在降解持久性有机污染物中的应用，具体涉及一种高效降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚的产碱杆菌菌株及其筛选纯化方法和应用。
技术介绍
2,2’,4,4’-四溴联苯醚是一类持久性有机污染物，具有高生物富集性和生物毒性。在多溴联苯醚同类有机物中，2,2’,4,4’-四溴联苯醚在环境介质中的含量仅次于十溴联苯醚，但是2,2’,4,4’-四溴联苯醚的毒性更大，主要表现在干扰生物体甲状腺激素的正常分泌，并具有神经毒性。2,2’,4,4’-四溴联苯醚的防治方法主要包括化学法和微生物法。但是，化学法具有以下缺点：一是化学药剂昂贵，成本高；二是化学药剂本身就是一种污染物，容易对环境造成污染；三是化学法降解产物的毒性更大，给环境造成二次污染。由于以上的缺点，限制了化学法在降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚污染中的应用。微生物法是一种经济环保的降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚的处理方法，但是2,2’,4,4’-四溴联苯醚是一种低生物可利用性和高化学热稳定性的有机物，在厌氧条件下难以被微生物降解。经过许多学者的研究发现，2,2’,4,4’-四溴联苯醚可以被微生物厌氧降解的。但是，现在被证明能降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚的微生物不多，并且降解效率不高。所以，关于厌氧微生物降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚有待进一步研究。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的不足，特别是克服现有厌氧微生物降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚技术的不足，提供一种可高效降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚的产碱杆菌菌株及其驯化纯化方法，还相应提供该产碱杆菌菌株在去除2,2’,4,4’-四溴联苯醚中的应用，具有工艺简单、经济环保、降解效率高等优点。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：一种产碱杆菌菌株，其特征在于，所述产碱杆菌(Alcaligenessp.)菌株的名称为产碱杆菌CJ01(Alcaligenessp.CJ01)，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2017571，保藏单位地址位于中国武汉大学，保藏日期为2017年10月9日。本专利技术的产碱杆菌菌株具有以下特征：革兰氏阴性菌，经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为产碱杆菌，主要生物学特征为：在斜面培养24h，形成乳白色菌落，菌落边缘整齐光滑，在厌氧条件生长良好；生理生化特性为V-P反应、甲基红反应、硫化氢反应和脲酶反应呈阳性，吲哚反应和明胶液化反应呈阴性，最适生长温度30℃，pH＝7。菌体16SrDNA序列如SEQNO：1所示。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法，包括以下步骤：(1)采样：从电子垃圾污染地区采取积水下面淤泥土壤样品，备用；(2)分离土著微生物：取步骤(1)所得土壤样品置于无菌容器中，加入无菌超纯水，经密封振荡后，取所得泥水混合液在无菌条件下进行离心，所得上层清液即为土著微生物菌悬液；(3)第一轮驯化：取培养基进行灭菌，然后加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，再加入步骤(2)的土著微生物菌悬液，通入氮气并密封，再在避光条件下恒温培养，得到第一轮驯化菌悬液；(4)第二轮驯化：取培养基进行灭菌，然后加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，再加入步骤(3)的第一轮驯化菌悬液，通入氮气并密封，再在避光条件下恒温培养，得到第二轮驯化菌悬液；(5)第三轮驯化：取培养基进行灭菌，然后加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，再加入步骤(4)的第二轮驯化菌悬液，通入氮气并密封，再在避光条件下恒温培养，得到第三轮驯化菌悬液；(6)纯化：采用第三轮驯化菌悬液进行平板划线，直至分离出单一菌落，得到产碱杆菌菌株；(7)保藏：将步骤(6)分离出的产碱杆菌菌株接种于斜面，冷藏，每个月传代一次。上述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法中，优选的，所述步骤(2)中，所述土壤样品与无菌超纯水的质量体积比为5g～10g∶90mL～95mL，所述振荡的转速为150转/min～200转/min，所述振荡的时间为30min～60min，所述离心的转速为5000转/min～10000转/min，所述离心的时间为5min～10min。上述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法中，优选的，所述步骤(3)中，加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液至2,2’,4,4’-四溴联苯醚在培养基中的终浓度为3mg/L～5mg/L，土著微生物菌悬液的接种量为5％～10％；所述步骤(4)中，加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液至2,2’,4,4’-四溴联苯醚在培养基中的终浓度为8mg/L～10mg/L，第一轮驯化菌悬液的接种量为5％～10％；所述步骤(5)中，加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液至2,2’,4,4’-四溴联苯醚在培养基中的终浓度为15mg/L～20mg/L，第二轮驯化菌悬液的接种量为5％～10％。上述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法中，优选的，所述步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中：所述培养基均包括以下浓度的组分：4.5mg/L～5.5mg/LNa2HPO4，2.3mg/L～2.7mg/LKH2PO4，4.5mg/L～5.5mg/LNH4Cl和0.45mg/L～0.55mg/LMgSO4·7H2O，pH＝7～7.2，溶剂为水；所述灭菌的温度均为115℃～121℃，所述灭菌的时间均为20min～30min；所述通入氮气的时间为5min～10min；所述恒温培养的温度均为25℃～30℃，所述恒温培养的时间均为7d～10d；所述恒温培养时，所述容器密封。上述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法中，优选的，所述步骤(3)中，待灭菌后的培养基温度降至70℃～85℃时，将含培养基的容器置于无菌操作台上，趁热加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，待培养基冷却后，再加入步骤(2)的土著微生物菌悬液；所述步骤(4)中，待灭菌后的培养基温度降至70℃～85℃时，将含培养基的容器置于无菌操作台上，趁热加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，待培养基冷却后，再加入步骤(3)的第一轮驯化菌悬液；所述步骤(5)中，待灭菌后的培养基温度降至70℃～85℃时，将含培养基的容器置于无菌操作台上，趁热加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，待培养基冷却后，再加入步骤(4)的第二轮驯化菌悬液。上述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法中，优选的，所述步骤(1)所得淤泥土壤样品、所述步骤(2)所得土著微生物菌悬液、所述步骤(3)所得第一轮驯化菌悬液、所述步骤(4)所得第二轮驯化菌悬液、所述步骤(5)所得第三轮驯化菌悬液、所述步骤(7)所得斜面均置于4℃下进行保存。作为一个总的技术构思，本专利技术还提供一种上述的产碱杆菌菌株或者上述的驯化纯化方法得到的产碱杆菌菌株在降解2,2’,4,4’-四溴联苯醚中的应用。上述的应用中，优选的，所述应用包括以下步骤：对含产碱杆菌菌株的斜面进行活化，然后加入含2,2’,4,4’-四溴联苯醚的水体或者土壤中进行处理，实现对水体或土壤中2,2’,4,4’-四溴联苯醚的降解。上述的应用中，优选的，所述应用包括以下本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产碱杆菌菌株，其特征在于，所述产碱杆菌(Alcaligenes sp.)菌株的名称为产碱杆菌CJ01，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M 2017571。

【技术特征摘要】
1.一种产碱杆菌菌株，其特征在于，所述产碱杆菌(Alcaligenessp.)菌株的名称为产碱杆菌CJ01，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNO：M2017571。2.一种如权利要求1所述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法，包括以下步骤：(1)采样：从电子垃圾污染地区采取积水下面淤泥土壤样品，备用；(2)分离土著微生物：取步骤(1)所得土壤样品置于无菌容器中，加入无菌超纯水，经密封振荡后，取所得泥水混合液在无菌条件下进行离心，所得上层清液即为土著微生物菌悬液；(3)第一轮驯化：取培养基进行灭菌，然后加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，再加入步骤(2)的土著微生物菌悬液，通入氮气并密封，再在避光条件下恒温培养，得到第一轮驯化菌悬液；(4)第二轮驯化：取培养基进行灭菌，然后加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，再加入步骤(3)的第一轮驯化菌悬液，通入氮气并密封，再在避光条件下恒温培养，得到第二轮驯化菌悬液；(5)第三轮驯化：取培养基进行灭菌，然后加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液，再加入步骤(4)的第二轮驯化菌悬液，通入氮气并密封，再在避光条件下恒温培养，得到第三轮驯化菌悬液；(6)纯化：采用第三轮驯化菌悬液进行平板划线，直至分离出单一菌落，得到产碱杆菌菌株；(7)保藏：将步骤(6)分离出的产碱杆菌菌株接种于斜面，冷藏，每个月传代一次。3.根据权利要求2所述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述土壤样品与无菌超纯水的质量体积比为5g～10g∶90mL～95mL，所述振荡的转速为150转/min～200转/min，所述振荡的时间为30min～60min，所述离心的转速为5000转/min～10000转/min，所述离心的时间为5min～10min。4.根据权利要求2所述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)中，加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液至2,2’,4,4’-四溴联苯醚在培养基中的终浓度为3mg/L～5mg/L，土著微生物菌悬液的接种量为5％～10％；所述步骤(4)中，加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液至2,2’,4,4’-四溴联苯醚在培养基中的终浓度为8mg/L～10mg/L，第一轮驯化菌悬液的接种量为5％～10％；所述步骤(5)中，加入2,2’,4,4’-四溴联苯醚的正己烷溶液至2,2’,4,4’-四溴联苯醚在培养基中的终浓度为15mg/L～20mg/L，第二轮驯化菌悬液的接种量为5％～10％。5.根据权利要求2所述的产碱杆菌菌株的驯化纯化方法，其特征在于，所述步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中：所述培养基均包括以下浓度的组分：4.5mg/L～5.5mg/LNa2HPO4，2.3mg/L～2.7mg/LKH2PO4，4.5mg/L～5.5mg/LNH4Cl和0.45mg/L～0.55mg/LMgSO4·7H2O，pH＝7～7.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾茁桐，晏铭，肖嵘，赵承豪，钟华，刘智峰，曾光明，汤琳，黄丹莲，
申请(专利权)人：湖南大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43