一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法及应用技术

本发明专利技术属于环境污染检测技术领域，涉及一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法和应用，包括下述步骤：(1)综合利用Avogadro和Gaussian 09等分子模拟软件，对6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原分子的几何结构，电荷分布和分子疏水表面情况进行模拟，对结果进行综合评价，筛选出最佳免疫半抗原(hapten 1)和包被半抗原(hapten 5)；(2)利用重氮化法将hapten 1与牛血清白蛋白偶联合成免疫原；(3)利用活性酯法将hapten 5与卵清蛋白偶联合成包被原；(4)多克隆抗体的制备及抗体特性测定。本发明专利技术成功运用分子模拟技术设计了酞酸酯类通用半抗原，并通过动物免疫实验进行验证，证明本发明专利技术方法可以大大提高半抗原的研发效率，节约时间和资金消耗，具有很好的预测能力，可为其他小分子半抗原的设计提供借鉴。

Design and application of a general hapten for phthalate esters of environmental hormones

The invention belongs to the field of environmental pollution detection technology, and relates to a design method and application of a phthalic acid ester environment hormone general structure semi antigen, including the following steps: (1) the geometric structure of 6 phthalate environmental hormones and 5 kinds of semi antigen molecules, and the charge distribution of 6 phthalate esters of environmental hormones and 5 kinds of semi antigen molecules are integrated in the following steps. The hydrophobic surface of the molecule was simulated and the results were evaluated synthetically. The optimal immune half antigen (hapten 1) and the envelope (hapten 5) were screened. (2) the diazotization method was used to combine the hapten 1 with bovine serum albumin to synthesize the immunogen; (3) the active ester method was used to combine the hapten 5 and the ovalbumin couple into the envelope; (4) Preparation of polyclonal antibody and determination of antibody characteristics. This invention successfully uses molecular simulation technology to design the phthalate general semi antigen, and verifies it by animal immune experiment. It proves that the method can greatly improve the efficiency of research and development of the hapten, save time and capital consumption, and have good prediction ability, and can provide reference for the design of his small molecule half antigen.

【技术实现步骤摘要】
一种酞酸酯类环境激素通用结构半抗原的设计方法及应用
本专利技术属于环境污染物检测
，具体涉及一种酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法和应用。
技术介绍
酞酸酯(PhthalicAcidEsters,PAEs)类化合物是塑料生产中最常用的一类塑化剂，占增塑剂市场份额的88％，大约包含30种化合物，主要用于生产医疗制品、塑料玩具、化妆品、食品包装、农用地膜等，由于酞酸酯与产品基质间为非共价结合，致使其在生产、加工和使用过程中不断向环境中释放，已成为全球性的最普遍的一类环境污染物。毒理学研究表明：酞酸酯是一类内分泌干扰物，具有雌激素效应，并表现出一定的生物累积性，是一种具有生殖毒性和发育毒性的环境雌激素，并与肥胖症和糖尿病的发生有关。美国国家环保局将酞酸二甲酯(DMP)、酞酸二乙酯(DEP)、酞酸二正丁酯(DBP)、酞酸二正辛酯(DOP)、酞酸二异辛酯(DEHP)和酞酸丁基苄酯(BBP)6种PAEs类化合物列为“优先控制污染物”，我国也将DMP、DBP、DOP列入环境优先控制污染物黑名单。卫生部也将16种酞酸酯列入《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第六批)》。因此，建立酞酸酯类环境激素快速，简便和灵敏的检测技术具有重要的社会意义。目前，酞酸酯类环境激素的检测多采用仪器分析法，需要昂贵的仪器设备和专业技术人员，对检材要求较高，样品前处理和提纯过程费时费力，不能满足现代检测对方便、快速、准确的要求。酶联免疫检测技术操作简便，对样本要求不高，近年来在酞酸酯检测领域得到广泛应用。但是，现有的免疫分析主要针对单个酞酸酯化合物，而实际检测中常为多个化合物同时被检出，因此实现酞酸酯类塑化剂的多残留检测更具有现实意义。酶联免疫检测技术基于抗原、抗体之间特异性识别，实现对检测样品中目标物的定性、定量分析，其关键在于制备出高特异性和高灵敏度的抗体，而抗体制备的关键在于半抗原的结构设计。酞酸酯类环境激素多残留检测需要制备出群选性的抗体，其前提就在于设计结构合理的通用型半抗原。半抗原与目标物尽可能相似是半抗原设计的一个主要原则，包括拓扑结构、电荷分布，疏水特性等。传统的半抗原设计大多为“试错法”，需要设计多个半抗原分子，然后根据大量的动物免疫实验效果来进行优化选择，不仅工作量大，周期长，成本高，而且带有很大的经验性和盲目性。针对这一问题，近年来研究者不断将一些新的设计手段引入到小分子目标物的半抗原设计中，其中尤以运用计算机分子模拟方法取得的成果最为突出。分子模拟技术可以提供丰富的小分子化合物的结构信息，如疏水性、电性、空间特性等，为深入了解半抗原的机构信息提供了强有力的工具，为建立基于“信息含量丰富”的半抗原设计提供了可能。目前经检索未发现有关于基于计算机模拟技术的酞酸酯类环境激素的通用半抗原设计的报道。
技术实现思路
本专利技术针对现有酞酸酯类环境激素半抗原设计中针对性和预见性差、工作量大、制备周期长的缺点，提供一种基于计算机模拟技术的酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法，从而理论指导半抗原结构设计和筛选，提高半抗原制备工作效率。技术方案：针对上述问题，本专利技术公开了一种基于计算机模拟的酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法，根据6种酞酸酯类环境激素目标检测物的共同分子结构(苯环和双侧链)，设计了5种半抗原。6种酞酸酯类环境激素的分子结构式为：5种半抗原的分子结构式为：所述的基于计算机分子模拟技术的酞酸酯类环境激素通用半抗原设计和应用的具体操作步骤为：(1)计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原：6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原的分子结构、电荷分布、分子表面疏水情况的计算模拟，通过对比11个分子的几何结构、电荷分布和分子表面疏水情况，综合评价后选择合适的免疫半抗原和包被半抗原。(2)免疫原制备：Hapten1含有氨基功能基团，以牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白，采用重氮化法合成免疫原：称取0.07mmol的Hapten1，用0.1mol/L的稀盐酸充分溶解，在0-4℃预冷30min；然后逐滴加入现配好的0.2mol/LNaNO2溶液，用淀粉碘化钾试纸检测NaNO2用量，直到试纸在15秒内变蓝为止，冰浴下搅拌反应1h，得到A液；称取0.0007mmol的牛血清白蛋白，溶于6mL碳酸盐缓冲液(0.05M，pH9.6)中，在4℃预冷30min，此为B液；冰浴下，将A液缓慢滴加到B液中，并用1MNaOH溶液调节pH维持在8.5左右，继续反应4h；于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。(3)包被原制备：Hapten5含有羧基功能基团，以卵清蛋白(OVA)为载体蛋白，采用活性酯法合成包被原：称取0.025mmol的Hapten5加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，待其完全溶解后加入0.05mmol的碳二亚胺(EDC)和0.05mmol的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，室温下搅拌反应过夜，得到A液；称取0.0008mmol的OVA溶解在5mL0.01mol/LPBS溶液中，为B液；在冰水浴中，将A液缓慢滴加到B液中，磁力搅拌下冰浴中继续反应6h，于PBS缓冲液(0.01mol/L，pH7.4)中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。(4)多克隆抗体的制备：选取4只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，采用快速佐剂进行免疫，首免取适量免疫原与等体积的快速佐剂混合后，注射于小鼠后腿肌肉内进行免疫，间隔21天后同法加强免疫一次；三免后第10天小鼠断尾取血，离心取血清，4℃保藏。(5)抗体特性测定：采用间接ELISA法测定抗血清效价和抑制率，包被原的包被浓度为0.5μg/mL。本专利技术的有益效果：本专利技术基于计算机分子模拟技术构建目标酞酸酯类环境激素和半抗原的空间构象、电荷分布和分子表面疏水图，通过比较来预测具有最佳免疫效果的免疫半抗原和最佳竞争效果的包被半抗原，以此取代传统半抗原设计所用的试错法，大大减少了盲目性和随机性，提高半抗原设计的研发效率和免疫性能，实现识别酞酸酯类环境激素群选性抗体的制备，具有很好的预测能力，并有助于揭示抗原抗体之间的识别原理。附图说明图1不同酞酸酯类环境激素和半抗原分子的优化构型图。图2不同酞酸酯类环境激素和半抗原分子mulliken原子电荷分布图。图3合成免疫原hapten1-BSA的紫外鉴定图。图4合成包被原hapten5-OVA的紫外鉴定图。图5免疫小鼠三免抗血清效价测定。具体实施方式为更好的理解本专利技术，下面结合具体的实施例来进一步阐明，应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术，而不用来限制本专利技术的范围。(1)计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原①使用Avogadro程序构建11个分子的三维结构，对每个小分子进行了构象搜索，选择其能量最低的构型作为结构优化的初始结构；②使用Avogadro程序对各分子结构进行分子力学几何优化，优化参数为：MMFF94力场，500步的最陡下降法，收敛标准为10-7；11个分子的优化结构如图1所示；从图1上可以看出，酞酸酯类小分子的共同特征为邻苯二甲酸酯上的邻苯二甲酸基团一侧。由于苯环上的离域共轭效应，特征基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法和应用，其特征在于根据6种酞酸酯类环境激素目标检物的共同分子结构(苯环和双侧链)设计5种半抗原，其分子结构式分别为：

【技术特征摘要】
1.一种酞酸酯类环境激素通用半抗原的设计方法和应用，其特征在于根据6种酞酸酯类环境激素目标检物的共同分子结构(苯环和双侧链)设计5种半抗原，其分子结构式分别为：(1)计算机模拟筛选最佳的免疫半抗原和包被半抗原：6种酞酸酯类环境激素和5种半抗原的分子结构、电荷分布、分子表面疏水情况的计算模拟，通过对比11个分子的几何结构、电荷分布和分子表面疏水情况选择合适的免疫半抗原和包被半抗原。(2)免疫原制备：Hapten1含有氨基功能基团，以牛血清白蛋白为载体蛋白，采用重氮化法合成免疫原：称取0.07mmol的Hapten1，用0.1mol/L的稀盐酸充分溶解，在0-4℃预冷30min；然后逐滴加入现配好的0.2mol/LNaNO2溶液，用淀粉碘化钾试纸检测NaNO2用量，直到试纸在15秒内变蓝为止，冰浴下搅拌反应1h，得到A液；称取0.0007mmol的牛血清白蛋白，溶于6mL0.05M，pH9.6的碳酸盐缓冲液中，在4℃预冷30min，此为B液；冰浴下，将A液缓慢滴加到B液中，并用1MNaOH溶液调节pH维持在8.5左右，继续反应4h；于0.01M，pH7.4的PBS缓冲液中4℃搅拌透析，每天换水3次，共透析3天，鉴定后分装于0.5mL离心管中，-20℃保藏待用。(3)包被原制备：Hapten5含有羧基功能基团，以卵清蛋白为载体蛋白，采用活性酯法合成包被原：称取0.025mmol的Hapten5加入N,N-二甲基甲酰胺中溶解，待其完全溶解后加入0.05mmol的碳二亚胺和0.05mmol的N-羟基琥珀酰亚胺，室温下搅拌反应过夜，得到A液；称取0.0008mmol的卵清蛋白溶解在5mL0...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙凤霞，彭夏雨，康立超，杨井泉，罗瑞峰，卢春霞，唐宗贵，陈霞，李红敏，王静，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：新疆,65