用于将核酸引入到植物中的方法和组合物技术

本公开提供用于将核酸引入植物中的组合物和方法。更具体地，本文公开用于将用于沉默靶基因的核酸(诸如双链RNA)引入植物中的方法和组合物。本文还公开通过使用此类方法和组合物获得的表现出对靶基因的修饰的植物。

Methods and compositions for introducing nucleic acids into plants

The present disclosure provides compositions and methods for introducing nucleic acids into plants. More specifically, this article discloses methods and compositions for introducing nucleic acids, such as double stranded RNA, into plants in silencing target genes. In addition, plants that have been modified to target genes are obtained by using such methods and compositions.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于将核酸引入到植物中的方法和组合物相关申请的交叉引用和序列表的并入本申请要求2015年6月3日提交的美国临时专利申请号62/170,447的优先权，所述申请以引用的方式整体并入。包含在文件“40-77_61028_0000_US_ST25.txt”(40千字节，在2015年6月3日创建，并且与2015年6月3日的美国临时申请号62/170,447一起提交)中的序列表以引用的方式整体并入。包含在文件“P34448WO00_Seq_Listing.txt”(40.8千字节，在2016年6月1日创建)中的序列表与本文一起提交并且以引用的方式整体并入本文。领域本文公开用于将核酸引入到植物中的方法和组合物。更具体地，本文公开用于将用于沉默靶基因的核酸(诸如双链RNA)引入植物中的方法和组合物。本文还公开通过使用此类方法和组合物获得的表现出对靶基因的修饰的植物。背景有需要将用于沉默靶基因的核酸(诸如DNA或RNA)引入到植物中，其中所述方法是可缩放的，以便实际应用于多株植物，诸如温室中的或在田间生长的植物中。大多数引入用于基因抑制的核酸的方法是麻烦的，并且因此通常仅在实验室或其他小规模环境中的单株植物上实际应用。例如，“基因枪”或“生物射弹”方法使用尺寸通常为0.5至2微米并且包被有DNA或RNA的金或钨颗粒，所述DNA或RNA已沉淀在颗粒上；使用由高压(通常几百到几千磅/平方英寸)下的气体驱动的“基因枪”将颗粒排放到保持在真空室中的植物上。使用诸如基因枪(Bio-RadLaboratories,Inc.)的设备的更近期的生物射弹方法使用较低的压力(以数百磅/平方英寸)，但仍需要使用氦气作为推进剂并且使用通常尺寸为0.5至小于2微米、必须预包被有核酸的金或钨颗粒；此外，每株植物必须单独处理，并且每次处理必须准备含有颗粒的单独“料筒”。这些限制使得基因枪方法对于用于处理大量植物(诸如温室中的和田间使用的)的真正可缩放性是不方便的。本公开涉及用于将核酸引入到植物中的各种方法和组合物，其中所述方法是可缩放的并且适合于在多株植物中使用，并且甚至适合于在田间生长的植物的农业用途。概要若干个实施方案涉及用于沉默植物中的靶基因的方法，所述方法包括呈任何顺序的以下步骤：(a)用尺寸大于约2.5微米的微粒磨损植物的表面；(b)将RNA施加至植物的表面，其中RNA包含具有与植物中靶基因的序列互补或相同的序列的至少19个连续核苷酸；由此靶基因沉默。若干个实施方案还涉及单步法，其中用包含尺寸大于约2.5微米的微粒和RNA的组合物磨损植物的表面，所述RNA包含具有与植物中靶基因的序列互补或相同的至少19个连续核苷酸；由此靶基因沉默。若干个实施方案涉及用于喷洒多株植物或多行植物的喷雾装置，所述喷雾装置包括推进剂源、至少一个喷雾嘴和含有包含微粒和核酸的组合物的贮存器，所述核酸包含具有与植物中靶基因的序列互补或相同的序列的至少19个连续核苷酸。在各种实施方案中，核酸是单链或双链的DNA或RNA，或者作为合成核酸或在微生物细胞中或作为微生物发酵产物提供。在一些实施方案中，核酸是siRNA或微RNA或微RNA前体。若干个实施方案涉及用于将核酸引入到整株植物中的装置，所述装置包括：(a)承载磨料的基体，和(b)核酸。在实施方案中，所述装置可以在单步法中使用，例如当核酸与磨料复合或以其他方式附接或结合至磨料时。在一些实施方案中，所述装置可在多步法中使用，例如当在植物或植物部分与磨料接触之前和/或之后施加核酸时。若干个实施方案涉及用于将核酸引入到植物中的方法，所述方法包括：(a)将包含核酸的组合物施加至植物的表面，和(b)使承载磨料的基体与表面接触；由此将核酸引入到植物中。若干个实施方案涉及用于将核酸引入到整株植物中的方法，所述方法包括：(a)将包含磨料和核酸的组合物施加至整株植物的表面，和(b)向表面施加压力；由此核酸被引入到整株植物中。若干个实施方案涉及用于将核酸引入到整株植物中的方法，所述方法包括呈任何顺序的以下步骤：(a)用非微粒微结构机械穿透整株植物的表面，和(b)使整株植物的表面与核酸接触。实施方案包括其中非微粒微结构是其上承载有选自由微米-或纳米-针、晶须、纤维和线组成的组的至少一种的基体的那些。在实施方案中，在穿透植物表面之后移除非微粒微结构，从而在植物中留下核酸。若干个实施方案包括通过本文所述的方法、组合物或装置处理的植物或植物田，其中，作为处理的结果并与未处理的植物相比，所述植物表现出期望的表型(诸如提高的产率、改善的生物或非生物胁迫耐受性、改善的抗病性、改善的除草剂敏感性、改善的除草剂抗性和改良的营养成分)。若干个实施方案包括此类植物的子代种子或可繁殖植物部分，以及由此类植物产生的商品。若干个实施方案包括用于提供植物的方法，所述植物表现出对其中靶基因的修饰，所述方法包括由通过本文所述的方法、组合物或装置处理的基源植物直接再生植物，其中靶基因的修饰是靶基因的不可遗传沉默、或靶基因的可遗传或表观遗传沉默、或靶基因的核苷酸序列的变化；实施方案包括表现出对靶基因的修饰的直接再生植物和从直接再生植物生长并表现出对靶基因的修饰的后续世代植物。在下面的详细描述和实施例中公开了其他方面和具体实施方案。附图简述图1绘示与视觉表型相关联的GFPmRNA相对丰度的定量qPCR测量(参见实施例7)。图2绘示针对不同的测试微粒的视觉沉默效率，如在实施例10中所述。“AlO”＝氧化铝(按筛目尺寸列出)，“DE”＝硅藻土(以硅藻土等级列出)，“SiC”＝碳化硅(按筛目尺寸列出)，“SLG”＝钠钙玻璃(按以微米计的直径范围列出)。详细描述除非另有定义，否则使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，所使用的术语和下面描述的制造或实验室程序是本领域熟知的并且是常常使用的。这些程序使用常规方法，诸如本领域中提供的那些和各种一般参考。在以单数提供术语的情况下，也可以设想由该术语的复数形式描述的方面。当在以引用的方式并入的参考文献中使用的术语和定义存在差异时，本申请中使用的术语应具有给定的定义。所使用的其他技术术语具有其使用的领域中的普通含义，如由各种领域专用字典例示的，所述词典例如“TheAmerican科学词典”(美国传统词典(theAmericanHeritageDictionaries)的编辑,2011,HoughtonMifflinHarcourt,Boston和NewYork)、麦格劳-希尔英汉双解科技大词典(the“McGraw-HillDictionaryofScientificandTechnicalTerms)”(第6版,2002,McGraw-Hill,NewYork)或“牛津生物学词典(OxfordDictionaryofBiology)”(第6版,2008,OxfordUniversityPress,Oxford和NewYork)。本公开并不旨在限制作用机制或作用模式。提供的参考仅是为了进行示意性的说明。除非另外规定，否则本说明书文本中的核酸序列当从左向右阅读时是以5’至3’方向给出。本领域技术人员将会知道，给定的DNA序列被理解为定义了除了用尿嘧啶(U)核苷酸置换DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于沉默植物中的靶基因的方法，所述方法包括呈任何顺序的以下步骤：(a)用尺寸大于约2.5微米的微粒磨损植物的表面；(b)向所述植物的表面施加RNA，其中所述RNA包含具有与所述植物中靶基因的序列互补或相同的序列的至少19个连续核苷酸；由此所述靶基因沉默。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.03 US 62/170,4471.一种用于沉默植物中的靶基因的方法，所述方法包括呈任何顺序的以下步骤：(a)用尺寸大于约2.5微米的微粒磨损植物的表面；(b)向所述植物的表面施加RNA，其中所述RNA包含具有与所述植物中靶基因的序列互补或相同的序列的至少19个连续核苷酸；由此所述靶基因沉默。2.如权利要求1所述的方法，其中(a)所述靶基因是所述植物的内源性基因或所述植物中表达的转基因，(b)所述植物中的所述靶基因是为所述植物的病原体或寄生生物的寄生植物、真菌或细菌的基因，(c)所述靶基因是多个靶基因或者(d)所述靶基因是来自多于一种物种的多个靶基因。3.如权利要求1所述的方法，其中(a)所述RNA是单链RNA，(b)所述RNA是双链RNA，(c)所述RNA是miRNA前体或小RNA，(d)所述RNA是不可转录的，(e)所述RNA不是自我复制的，(f)所述RNA包含19-500个核苷酸或碱基对，或(g)所述RNA不包含在病毒载体中，也不由质粒编码。4.如权利要求1所述的方法，其中(a)所述微粒选自由以下组成的组：矿物磨料、金属磨料、合成磨料和有机磨料，(b)所述微粒选自由以下组成的组：氧化铝、碳化硅、二氧化硅、钠钙玻璃、硅石(“硅藻土”)、燧石、石英、石榴石、二氧化硅、浮石、砂、长石、方解石、钢、钨、陶瓷、碳化硼、碳化钨，(c)所述微粒的平均尺寸在约2.5微米至约50微米的范围内，或(d)所述微粒由基体承载、附接至所述基体或嵌入所述基体中。5.如权利要求1所述的方法，其中所述微粒、所述RNA或两者还与以下项一起施加：(a)选自由以下组成的组的至少一种：水、杀生物剂、螯合剂、缓冲剂、非离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、消泡剂、耐雨水冲刷剂和光保护剂，(b)选自由以下组成的组的至少一种：载剂、表面活性剂、渗透剂、有机硅氧烷、多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸除草剂分子、非多核苷酸杀虫剂、安全剂、昆虫引诱剂和昆虫生长调节剂，或(c)选自由以下组成的组的至少一种杀虫剂：马铃薯块茎特异蛋白、植物凝集素、植物蜕皮类固醇、苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、侧孢芽孢杆菌杀虫蛋白和球形芽孢杆菌杀虫蛋白。6.一种用于将核酸引入到植物中的方法，所述方法包括：(a)呈任何顺序的以下步骤：(i)将包含核酸的组合物施加至植物的表面，和(ii)使承载磨料的基体与所述表面接触；或(b)呈任何顺序的以下步骤：(i)用尺寸大于约2.5微米的微粒磨损植物的表面；和(ii)将包含核酸的组合物施加至所述植物的表面，其中所述核酸包含具有与所述植物中靶基因的序列互补或相同的序列的至少19个连续核苷酸；由此将所述核酸引入到所述植物中。7.如权利要求6所述的方法，其中(a)所述核酸是DNA，(b)所述核酸是呈质粒或病毒载体形式的DNA，(c)所述核酸是单链RNA，(d)所述核酸是双链RNA，(e)所述核酸是DNA和RNA的组合，(f)所述核酸是miRNA前体或小RNA，(g)所述核酸是不可转录的RNA，(h)所述核酸是不自我复制的DNA或RNA，(i)所述核酸是包含19-50...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·黄，A·B·伊安多里诺，G·J·皮尔，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US