一种白叶枯菌小种分离鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种白叶枯菌小种分离鉴定方法，属于小种鉴定技术领域。提取样品中的微生物的总核酸并构建高通量测序文库；寻找基因组上的变异位点；通过滑动平移筛选高多态性位点，并在候选位点两侧设计多重扩增引物；利用固体培养基分离样品中的单菌落并做进一步纯化，以获得单克隆菌落；提取菌落的基因组DNA后利用上述步骤设计的引物进行扩增并测序；基于测序结果单克隆菌落进行分型，具有不同基因型的菌落作为不同的小种进行后续研究。本方法不需要预先知道样品中的小种数量以及丰度等信息，也无需传统的筛选过程中所需要生理生化鉴定试验，只需通过高通量测序和扩增即可分离培养出样品中的全部小种，过程简单、快速且流程规范。

Isolation and identification of a species of bacterial leaf blight

The invention discloses a method for isolation and identification of bacterial blight fungus, belonging to the technical field of small seed identification. The total nucleic acid of the microorganism in the sample is extracted and the high throughput sequencing library is constructed; the mutation loci on the genome are searched, the high polymorphism loci are screened by sliding translation, and the multiple amplification primers are designed on both sides of the candidate loci, and the single colony in the sample is separated by the solid medium and further purified to obtain the monoclonal bacteria. When the genomic DNA was extracted, the primers designed by the above steps were amplified and sequenced, and the monoclonal colonies based on the sequencing results were typed, and the colonies with different genotypes were followed by different species for subsequent studies. The method does not need to know the number and abundance of the small species in the sample in advance, and there is no need for the physiological and biochemical identification test in the traditional screening process. It is only necessary to isolate and cultivate all the small species in the sample by high throughput sequencing and amplification, and the process is simple, fast and process standard.

【技术实现步骤摘要】
一种白叶枯菌小种分离鉴定方法
本专利技术属于小种鉴定
，具体涉及一种白叶枯菌小种分离鉴定方法。
技术介绍
白叶枯菌每年对水稻生产造成巨大的损失，严重情况下可能导致绝收。不同的白叶枯小种对水稻品种的危害程度有很大的差异。在农业防治中针对不同的白叶枯小种应对策略也不同，因此确定分离、鉴定感染的是哪个小种是农业防治的第一步。小种又称生理小种、株系等，是指形态上没有明显差异，但在生理生化特性、培养性状、致病性等方面存在差异的同种微生物的不同群体。由于这些小种在致病性等特性上具有明显的差异，因此在做菌种分离和鉴定时往往需要做到小种的水平才具有意义。在现有技术中，至少存在以下问题：由于各小种之间在形态上没有明显差异，在获取样品并做分离培养后依然无法知道样品中包含有几个小种，具体是什么小种，只能通过一系列稀释涂布实验来获得单个的菌落，并进行一系列的生理生化测试来一一鉴别。这导致三个问题，一是对所需要的稀释梯度没有任何信息，只能盲目的稀释后选择若干梯度进行后续实验；二是某些小种会被漏筛；三是挑取需反复对多个单克隆菌落做生理生化分析来筛选小种。其过程耗费大量人力物力，且不够准确全面。
技术实现思路
本发的明目的是提供一种白叶枯菌小种分离鉴定方法。本专利技术所采用的技术方案是：一种白叶枯菌小种分离鉴定方法，包括以下步骤：(1)提取需要分离和鉴定的水稻叶片的总核酸，然后构建高通量测序文库；(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序，并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上；(3)根据比对结果获取所有的变异位点，然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目，计算每个窗口的多态性，选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点；(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域，在保守区域设计扩增引物；(5)将需要分离和鉴定的水稻叶片做10倍稀释后涂平板，恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落；(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增，对扩增产物测序后分型；(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个；若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在，则重新挑取菌落纯化并重复上述过程，直到获得该白叶枯菌小种。进一步地，所述步骤(1)中提取需要分离和鉴定的水稻叶片的总核酸时需要充分裂解细胞，确保提出每个小种的基因组序列。进一步地，所述步骤(2)中测序时产生的测序片段数量要达到200倍数据，确保所有小种均可以被有效检测到。进一步地，所述步骤(3)中分子标记位点的筛选以窗口平移的方式进行，窗口长度设为L；在窗口平移的过程中仅仅考虑可以完整覆盖该窗口的测序片段，其他测序片段均不考虑。进一步地，所述步骤(3)中变异位点的分析以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为该窗口内的一个基因型。更进一步地，所述获得该窗口的所有候选基因型，统计每类基因型的测序片段数量，并除以完整覆盖该窗口的测序片段的总数量，从而获得该基因型的频率。进一步地，混合样品完成基因组测序后获得准确获得所有的基因型，排除错误的基因型。优选地，所述步骤(3)中选取的分子标记位点在该物种中具有特有的特征片段，且在混合测序的样品中表现出很高的多态性，多态性的计算方法为：进一步地，所述步骤(3)中选取的分子标记在基因组上处于单拷贝区域，基因组上其他位置不存在对该区域形成干扰的基因组片段；单拷贝区域的判断标准为：1.基于相似性判断：如果有参考基因组，则首先保证参考基因组上其他位置没有相似性大于90％、匹配长度大于100bp的区段；2.基于测序深度的判断：其测序深度不超过临近区域平均测序深度±3倍标准差，临近区域指的是上下游各1，000bp的基因组区域。进一步地，所述步骤(4)中分子标记两侧应有适合于引物设计的保守区域；对于长度为L的一个滑动窗口，窗口在基因组上的起始位置设为S，该窗口终止位置为E，则窗口左侧保守区定义为坐标位置小于S、在测序数据中以及已有的数据中均未发现变异的连续n个碱基位点，窗口左侧保守区定义为坐标位置大于E、在测序数据中以及已有的知识中均未发现变异的连续n个碱基位点(n≥50)；所述保守区内设计的引物3末端不含有低复杂序列，如polyA\T\C\G。进一步地，所述步骤(5)中稀释涂平板后要依据形态特征挑取目标微生物的菌落，并确保挑取的是单个的菌落；在进一步纯化后挑取单克隆菌落，并通过菌落PCR获得每个位点的扩增产物；对扩增产物测序后即可获得每个扩增位点的基因型信息。理论上每个克隆的每个扩增位点只有一个基因型，若出现两个及以上的基因型，且次高丰度的基因与最高丰度的基因型的丰度比值超过0.01；则认为该菌落为非单克隆菌落，需重新纯合；若丰度比值低于0.01，则认为其他次高丰度的基因型为测序错误引入，最高丰度基因型为该扩增位点的真实基因型；做稀释涂平板时，稀释的倍数应以最低基因型的频率为参考值：低于该值则会造成部分小种在在固体培养基丢失，高于该值则无法确保每个小种的都可以形成单菌落。优选地，比较两个单克隆菌落是否相同时，要求每个扩增位点的基因型均相同才认为是两者属于同一个小种，否则为不同。进一步地，一次性确定混合样品中的小种数量，以保证不会漏筛某些小种；各基因型丰度的比值可以确定稀释涂布的倍数，提高筛选的效率。本专利技术具有以下优点：本专利技术的方法不需要预先知道样品中的小种数量以及丰度等信息，也无需传统的筛选过程中所需要生理生化鉴定试验，只需通过高通量测序和扩增即可分离培养出样品中的全部小种，过程简单、快速且流程规范。对每个单克隆的筛查过程简单、快速、准确，且通量高，普遍适用于临床、农业以及食品等行业快速筛查致病小种，以及从各种复杂环境样品中分离目标微生物小种的研究。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施方式作进一步地详细描述。如未加特殊说明，本专利技术中所用试剂均为市场上常见试剂，大多数生物技术公司均有销售，且效果等同。水稻叶片感染的白叶枯菌小种的分离和鉴定本实施例中，感染白叶枯的水稻叶片为材料，本实施例的目的是分离鉴定出叶片中存在的白叶枯菌的不同小种。一、混合基因组DNA的提取从叶片病斑部位剪取1mg叶片，用去离子水将其表面清洗后加入液氮研磨。然后用PureLinkMicrobiome纯化试剂盒(货号：A29790，生产单位为赛默飞世尔科技(中国)有限公司)提取总的基因组DNA。二、高通量测序文库的构建及测序利用紫外分光光度计(NanoDroponeC，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)测定核酸的OD260/280值为1.92。用Qubit对提取核酸进行定量，确定提取的DNA浓度达到文库构建的量。采用CovarisSystem超声波打断仪(CovarisM220)，将待测DNA打断成250bp大小，然后按照Iontorrent的全基因组文库构建试剂盒构建面PCR扩增的高通量测序文库。采用IontorrentS5高通量测序仪进行测序。三、多态性分子标记位点的筛选方法3.1测序片段与基因组序列比对采用bowtie2(版本号2.1.0)把所有测序片段比对到白叶枯菌的参考基因组上，白叶枯菌的参考基因组的版本号为NC＿0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取需要分离和鉴定的水稻叶片的总核酸，然后构建高通量测序文库；(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序，并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上；(3)根据比对结果获取所有的变异位点，然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目，计算每个窗口的多态性，选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点；(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域，在保守区域设计扩增引物；(5)将需要分离和鉴定的水稻叶片做10倍稀释后涂平板，恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落；(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增，对扩增产物测序后分型；(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个；若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在，则重新挑取菌落纯化并重复上述过程，直到获得该白叶枯菌小种。

【技术特征摘要】
1.一种白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取需要分离和鉴定的水稻叶片的总核酸，然后构建高通量测序文库；(2)采用高通量测序的方法对文库进行高覆盖深度的测序，并将测序结果比对到相应物种的参考基因组上；(3)根据比对结果获取所有的变异位点，然后按照窗口平移获得每个窗口的基因型数目，计算每个窗口的多态性，选择多态性高且处于单拷贝区域作为候选分子标记位点；(4)在每个分子标记位点的两侧寻找保守区域，在保守区域设计扩增引物；(5)将需要分离和鉴定的水稻叶片做10倍稀释后涂平板，恒温培养后挑取单个的菌落并在新的固体培养基平板上纯合后获得单克隆的菌落；(6)提取菌落的核酸后用步骤(4)设计的引物进行扩增，对扩增产物测序后分型；(7)所有分型结果相同的单克隆仅保留一个；若有部分已发现基因型在所有克隆中都不存在，则重新挑取菌落纯化并重复上述过程，直到获得该白叶枯菌小种。2.根据权利要求1所述的白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取需要分离和鉴定的水稻叶片的总核酸时需要充分裂解细胞，确保提出每个小种的基因组序列。3.根据权利要求1所述的白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)中测序时产生的测序片段数量要达到200倍数据，确保所有小种均可以被有效检测到。4.根据权利要求1所述的白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)中分子标记位点的筛选以窗口平移的方式进行，窗口长度设为L；在窗口平移的过程中仅仅考虑可以完整覆盖该窗口的测序片段，其他测序片段均不考虑。5.根据权利要求1所述的白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)中变异位点的分析以测序片段为单位展开，标记出每条测序片段上与参考基因组不同的每个碱基位点及其突变类型；把具有相同突变碱基位点和突变类型的reads定义为该窗口内的一个基因型。6.根据权利要求4或5所述的白叶枯菌小种分离鉴定方法，其特征在于，所述获得该窗口的所有候选基因型，统计每类基因型的测序片段数量，并除以完整覆盖该窗口的测序片段的总数量，从而获得该基因型的频率。7.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：方治伟，方光明，李伦，周俊飞，刘致浩，彭海，高丽芬，李丽丽，陈丽红，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42