一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用制造技术
Application of a CD44 in monitoring deterioration of non-alcoholic fatty liver disease
The present invention discloses an application of CD44 in the process of monitoring the deterioration of nonalcoholic fatty liver disease, including the following steps: Animal grouping, model construction, liver tissue fat staining, blood lipid and liver enzyme activity determination, immunohistochemical staining and gene expression profile analysis; through the above steps, the invention is established by establishing positive The rat model of normal liver, fatty liver, degenerative liver, diseased liver and cancerous liver was used to detect the changes of CD44 during the malignant transformation of hepatocytes, and the expression of CD44 in the liver tissues of the control group was very small, and the expression of CD44 in the liver tissue of the fatty liver group was significantly higher than that of the control group, while the CD in the liver tissue of the denatured group, the lesion group and the cancerous group was in the rat liver tissue. The expression of 44 was significantly higher than that in the fatty liver group and the control group. The expression of CD44 in the carcinogenesis group was the highest, the expression of CD44 in the cancerous group was the highest. The high expression of CD44 in the liver tissue promoted the process of hepatocyte degradation and transformation.
【技术实现步骤摘要】
一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用
本专利技术涉及生物医药
，涉及一种循环血CD44异常表达与非酒精性脂肪性肝病进展的新发现与应用，具体地说，涉及一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用。
技术介绍
目前，肝细胞性肝癌(HCC)仍是我国最常见的恶性肿瘤之一。非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是遗传-环境-代谢应激相关因素所致的临床病理综合征，需排除过量饮酒史和其他明确肝损害因素，以肝细胞脂肪变性、坏死、炎性细胞浸润和脂肪积贮等为特征，可从非酒精性单纯性脂肪肝进展为非酒精性脂肪性肝炎（NASH）。NASH包涵肝纤维化、肝硬化（LC）和HCC疾病谱。NAFLD发病率明显上升，已为最常见慢性肝病、并逐步成为继乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染外诱发HCC的主要致病因素，已引起医学界的高度重视。经典“二次打击”学说是首次以胰岛素抵抗致肝脂肪变（脂肪肝可逆），再次是肝细胞TG储存过量致脂质过氧化及氧化应激等，为NASH发生重要原因。人类CD44基因位于11号染色体短臂，全长约50kb，由20个高度保守外显子组成，每个...
【技术保护点】
一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用。2.根据权利要求1所述的一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：（1）动物分组：随机选取雄性Sprague-Dawley大鼠共94只，其中，随机选取10只为空白对照组，其余84只，随机分配为脂肪肝组和诱癌组各42只；（2）模型构建：将步骤（1）中的94只雄性Sprague-Dawley大鼠于温度22±2℃、12h光/暗周期和湿度55%的环境中饲养；空白对照组大鼠予以普通饲料喂养；脂肪肝组大鼠予以高脂饲料喂养；诱癌组大鼠予以高脂饲料加0.05%的2-乙酰氨基芴颗粒饲料喂养；每两周取1只空白对照组的正常鼠、一组脂肪肝组的高脂鼠和一组诱癌组的诱癌鼠，每组六只大鼠，以乙醚麻醉，经鼠腹心脏抽取5ml血液，分离血清置-20℃保存；摘取鼠肝组织，取每周摘取的鼠肝组织至少3份于10%中性福尔马林中固定，再取每周摘取的鼠肝组织至少5份于液氮速冻后放-80℃冰箱保存为冰冻切片；将福尔马林固定的鼠肝组织，制备成鼠肝组织石蜡切片；取其中1份鼠肝组织石蜡切片，对鼠肝组织石蜡切片进行病理组织学检查，将鼠肝组织细分为对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组;将相应的-80℃的冰冻切片分为对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组；将鼠血清相应地分为对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组；（3）肝组织脂肪染色：采用油红O染色进行测试，根据试剂盒要求，按照贮备液：稀释液=5:2的比例配置应用液，并用慢速滤纸过滤；将步骤（2）预先制作好的并保存在-80℃冰箱中的对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组各组鼠肝组织冰冻切片放置室温回温5-10min，然后直接放入装有应用液的染缸中染色10-15min，之后37℃蒸馏水洗5-20s；苏木精复染3-5分钟，37℃蒸馏水洗30-60s；未待表面水干透即可滴加水性封固剂于玻片表面进行封片；在OLYMPUSIX71光镜下进行观察、摄片；通过ImageProPlus6.0软件图像分析系统，进行图像分析半定量研究；（4）血脂和肝酶活性测定：取步骤（2）中的鼠血清进行总胆固醇和甘油三酯水平测定，设空白管、校准管和样本管；在空白管中加入10µl蒸馏水和1000µl工作液，校准管中加入10µl校准品和1000µl工作液，样本管中加入10µl样本和1000µl工作液；将各管混匀后37℃孵育10分钟，取200µl用酶标仪在波长510nm测定各孔吸光度A，根据公式计算总胆固醇和甘油三酯含量；（5）免疫组织化学染色：取步骤（2）中按照病理学分组的对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组各组鼠肝组织的石蜡切片，温水中烫平贴于硅化处理的载玻片上，置于80℃干燥箱烤片1-2h；再将切片置二甲苯中浸泡5min两次脱蜡，梯度酒精脱水，自来水冲洗5min；先将高压锅水煮沸，加入EDTA缓冲液，所述EDTA缓冲液的pH=9.0，将玻片置于染色架上放入高压锅中，300W维持20min后取出自然冷却至室温，PBS冲洗5min三次，在每张切片上滴加3%H2O2，室温孵育15min，PBS冲洗5min三次；滴加1:500的CD44抗体，室温孵育1h，PBS冲洗5min三次，甩去多余水分，滴加反应增强液室温孵育20min，PBS冲洗5min三次，后滴加酶标抗小鼠/兔免疫球蛋白G聚合物，室温孵育30min，PBS冲洗5min三次；将配好的DAB染液滴加到组织上5min，观察显色程度，反应结束后自来水冲洗5min，然后苏木素复染10-30s，流水冲洗，盐酸-乙醇分化5-10s，流水冲洗，温水蓝化5min；最后梯度酒精脱水，吹干切片，中性树脂封固组织切片，光镜OLYMPUSMX53观察、摄片，通过ImageProPlus6.0软件图像分析系统测定每个视野的累积积分光密度值及有效统计区域的面积，计算光密度平均值，取其平均值代表肝组织中CD44表达的相对水平，进行图像分析半定量研究。3.根据权利要求2所述的一种CD44在监测非酒精性脂肪性肝病恶化转化过程中的应用，其特征在于，所述步骤（5）后还包括步骤（6）：肝总RNA制备与CD44转录分析，具体包括以下步骤：取对照组、脂肪肝组、变性组、病变组和癌变组的各组鼠肝组织100mg组织放于玻璃研磨器内，加入1mLTRIreagent进行组织均质化，后全部再倒入EP管中，颠倒混匀10下，室温静置5min；再加0.2mL氯仿，充分混匀，室温静置5min，后12000rmp、4℃离心15min；将上层水相转入新的无菌EP管中，加入0.5mL异丙醇混匀，后12000rmp、4℃离心10min；移除离心后的上清液，加1mL现配的80%的乙醇振荡洗涤RNA沉淀一次，后75...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚敏，姚登福，王理，方淼，赛文莉，董志珍，
申请(专利权)人：南通大学，南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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