一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02高效降解多环芳烃的方法技术

本分案申请涉及一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02高效降解多环芳烃的方法。该菌株保藏编号为CGMCC No.10354，其16SrRNA序列如SEQ ID No:1所示。本发明专利技术筛选的菌株BW02具有高效多环芳烃降解功能，该菌株在中性和偏碱性条件下具有良好的降解性能，对于氧气需求量相对较低，于15℃低温环境、盐浓度3％时芘降解率高，适合海底环境，对于海洋沉积污染物中的多环芳烃具有良好降解作用。

Efficient degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) by BW02, a low temperature salt tolerant and highly effective degrading strain of proton

The application involves a method of efficiently degrading polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) from a strain BW02 with low temperature, salt tolerance and high efficiency. The strain is kept at CGMCC No.10354, and its 16SrRNA sequence is shown as SEQ ID ID No:1. The strain BW02 screened by the invention has the function of high performance polycyclic aromatic hydrocarbon degradation, which has good degradation performance under neutral and partial alkaline conditions, relatively low oxygen demand, high degradation rate of pyrene at 15 C low temperature environment and 3% salt concentration, suitable for marine environment and polycyclic aromatic hydrocarbons in marine sedimentary pollutants. It has a good degradation effect.

【技术实现步骤摘要】
一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02高效降解多环芳烃的方法本申请为申请号为2017111277435、申请日为2017年11月15日、专利技术名称为“一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02和其用途”的分案申请。
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02和其用途。
技术介绍
多环芳烃(PolycyclicAromaticHydrocarbons简称PAHs)：是指2个及2个以上苯环相互结合，以线状、角状或簇状排列而成的稠环化合物，基本单位为苯环，结构稳定不易降解，并且能够通过生物积累作用以及生物放大作用对人类的生产及生活造成严重健康危害。含有2-3个苯环，被称为低分子量PAHs(Low-molecular-weight，简称LMW-PAHs)，如萘、蒽和菲。带有4-6个苯环的高分子量PAHs(High-molecular-weight，简称HMW-PAHs)，如芘、苯并R和苯并[a]芘等。芘由四个苯环组成，是高环多环芳烃的代表物，其本身对细胞不产生毒性，摄入人体通过代谢形成醒类化合物，该类物质具有强致癌性。一般来说，高分子量的PAHs化学结构稳定，难以被一般微生物所利用。近些年来，随着工业的迅猛发展，石油、煤、天然气等自然资源开发利用急剧加快，环境中的多环芳烃污染有着明显的上升趋势。迄今已发现200多种多环芳烃类化合物。其中海洋沉积物、陆地土壤中与空气中均含有大量的多环芳烃，因其具有高度的稳定性、难降解、毒性强，且具有累积效应等危害受到环境科学者的广泛关注，许多国家和地区把多环芳烃类物质列为严重的环境污染物之一，美国环保局更是在二十世纪八十年代初已将16株未带有分支的PAHs确定为环境中优先控制污染物。自然界(土壤污染物，海洋沉积污染物)中存在许多对多环芳烃有降解作用的微生物，这些微生物具有分布广泛、代谢类型多样、降解能力高效、代谢产物多样、环境适应稳定性较强以及遗传可变性高等优点，因而成为研究生物降解的热点。但不同的微生物降解能力不同，降解机制也各不相同，因此寻找最适宜降解芘的菌株引起了越来越多研究者的关注。
技术实现思路
本专利技术为弥补现有技术的不足，提供了一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02和其用途。一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02，拉丁文学名为Rhodococcusqingshengii。其16SrRNA序列如SEQIDNo:1所示。所述的菌株BW02采集于大连新港石油污染海域，富集分离所得。所述的具有芘降解功能的低温细菌BW02已提交保藏，具体保藏信息如下：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2015年01月13日；保藏编号：CGMCCNo.10354；本专利技术第二个目的请求保护上述菌株BW02在高效降解多环芳烃芘上的应用。本专利技术第三个目的请求保护上述菌株BW02降解芘的方法，步骤为：1)向锥形瓶加入ASM培养基，于pH7.5，121℃灭菌30min；2)向灭好菌的ASM培养基中分别加入微量元素溶液0.5ml和芘，使芘最终浓度为1mg/ml；3)选取菌龄为48h的菌株制备菌悬液，控制菌株的菌体浓度109cfu/ml，以8％的接种量接入芘含量为1mg/ml的ASM培养基中，模拟海底环境厌氧条件，调节培养基pH7.5，于15℃静置培养15d。进一步的，所述ASM培养基配方：NaCl：30g，NH4NO3：1g，KH2PO4：0.2245g，Na2HPO4·12H2O：5g，天然海水1000ml，微量元素溶液：10ml。进一步的，所述微量元素溶液配方：CaCl22mg，FeCl·6H2O50mg，CuSO40.5mg，MnCl·4H2O0.5mg，ZnSO4·7H2O10mg，蒸馏水1000ml。本专利技术筛选的菌株BW02具有高效芘降解功能，该菌株在中性和偏碱性条件下具有良好的降解性能，对于氧气需求量相对较低，于15℃低温环境、盐浓度3％时芘降解率高，适合海底环境，对于海洋沉积污染物中的多环芳烃具有良好降解作用。附图说明图1菌株BW02菌落形态；图2菌株BW02电镜扫描形态；图3菌株BW02的系统发育树的构建；图4菌株BW02的生长曲线；图5菌龄对菌株BW02芘降解性能的影响；图6接种量对菌株BW02芘降解性能的影响；图7不同pH，温度与转速对菌株BW02芘降解性能的影响；图8NaCl浓度对菌株BW02芘降解特性的影响；图9时间对菌株BW02芘降解性能的影响；图10无机氮源对菌株BW02芘降解性能的影响；图11Na2HPO4浓度对菌株BW02芘降解性能的影响；图12菌株BW02对芘的降解过程中产生代谢产物。具体实施方式下面通过附图和具体实施例详述本专利技术，但不限制本专利技术的保护范围。如无特殊说明，本专利技术所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。实施例1菌株BW02培养LB培养基(g/L):胰蛋白胨(Tryptone)10g；琼脂(Agar)15g；酵母浸粉(YeastExtract)5g，NaCl10g，去离子水1L，调节pH至7.0，液体培养基则不添加琼脂。ASM无机盐培养(g/L):NaCl30g；MgSO4，0.35g；NH4NO31g；KCI0.7g，Na2HPO4.12H2O5g；KH2PO40.2245g；pH7.5，最后加100ul微量元素溶液。微量元素溶液(mg/L):CaCl22mg；FeCl3.6H2O5mg；GuSO40.5mg；MnCl2.4H200.5mg；ZnSO4.7H2O10mg；蒸馏水1000ml。将纯化后的菌株接种到LB固体培养基上培养48h后观察其菌落形态。同时将适当浓度待测菌株菌悬液滴于5mm×4mm的硅片上，用2.5％的戊二醛固化2-4h，然后用pH＝7.3的磷酸缓冲液洗涤，乙醇梯度脱水，最后采用乙酸异戊酯进行置换，真空干燥，用扫描电子显微镜(日立S-4800场发射)进行菌体观察。(1)菌落形态特征菌株BW02的菌落形态为：在LB培养基上培养7天后，菌落圆形凸起，黄粉色，表面光滑湿润，边缘整齐。(2)菌株形态及其生理生化特性如图1所示，高效芘降解菌株BW02革兰氏阳性，在LB固体培养基上呈橘黄色，表面湿润光滑凸起，边缘整齐，不透明。如图2所示，菌体为杆状，非成对出现，无鞭毛，长约0.8-2μm，宽约0.3-0.6μm。菌株BW02可以蔗糖、乳糖、糊精为唯一碳源，不能利用海藻糖、菊粉及甘露醇。(G+C)mol％为59.1％。在NaCl浓度0-20％范围内均能生长，最适NaCl浓度3％，生长的温度范围4-30℃，最适温度范围15-20℃，pH范围4.5-10.5，最适pH7.0-8.0，利用16SrRNA序列构建菌株BW02系统发育树(图3)，菌株BW02和Rhodococcusqingshengii和Rhodococcusdegradans亲缘关系最近，同源性高达98.03％，结合菌株的形态特征及生理生化特征分析，菌株BW02经鉴定R.qingshengii。实施例2高效芘降解菌株BW02的生长曲线的测定实验采用可见分光光度法值法测定芘的高效降解菌株生长曲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02高效降解多环芳烃的方法，其特征在于，菌株BW02保藏编号为CGMCCNo.10354，其降解步骤为：1)向锥形瓶加入ASM培养基，于pH7.5，121℃灭菌30min；2)向灭好菌的ASM培养基中分别加入微量元素溶液0.5ml和多环芳烃，使多环芳烃最终浓度为1mg/ml；3)选取菌龄为48h的菌株制备菌悬液，控制菌株的菌体浓度10

【技术特征摘要】
1.一株具有低温耐盐高效芘降解功能菌株BW02高效降解多环芳烃的方法，其特征在于，菌株BW02保藏编号为CGMCCNo.10354，其降解步骤为：1)向锥形瓶加入ASM培养基，于pH7.5，121℃灭菌30min；2)向灭好菌的ASM培养基中分别加入微量元素溶液0.5ml和多环芳烃，使多环芳烃最终浓度为1mg/ml；3)选取菌龄为48h的菌株制备菌悬液，控制菌株的菌体浓度109cfu/ml，以8％的接种量接入多环芳烃含量为1mg/ml的ASM培养基中，调节培养基pH7.5，于15℃静置培养15d。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：刘秋，李佳怡，袁峰皓，于基成，
申请(专利权)人：大连民族大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21