一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法技术

本发明专利技术公开了一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法。所述LAMP引物组包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。本发明专利技术的LAMP引物组及其检测方法检测腐烂茎线虫的特异性、灵敏性非常好，不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，还可以从多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品中直接检测出腐烂茎线虫，检测灵敏度可达到1/1000单条虫DNA。本发明专利技术为腐烂茎线虫的快速检测鉴定和早期诊断提供了一个新的检测方法，其具有准确、灵敏、稳定和结果判定直观的优点，该发明专利技术操作简便、实用性强，对于口岸和调运检疫以及产地监测工作具有重要的意义和应用价值。

A LAMP primer set and method for rapid detection of decayed stem nematodes from complex samples

The invention discloses a LAMP primer group and a method for rapid detection of decaying nematode from complex samples. The LAMP primer group consists of an external primer F3/B3, a pair of primers FIP/BIP and a ring primer LF, and the sequence is shown in SEQ ID ID NO.1 ~ 5. The LAMP primer group and its detection method detect the specificity and sensitivity of the rotten stem nematode, which can not only detect and identify the individuals of different insect states (eggs, larvae, females and males) of the rotten stem nematode, but also detect the decay directly from samples of mixed nematodes, plant tissue samples and soil samples. The detection sensitivity of stem nematode can reach 1/1000 single worm DNA. The invention provides a new detection method for the rapid detection and identification of rotten stem nematode and early diagnosis. It has the advantages of accuracy, sensitivity, stability and intuitionistic results. The invention is simple and practical. It is of great significance and application value for the port and the transportation and quarantine as well as the monitoring of the origin.

【技术实现步骤摘要】
一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法
本专利技术属于病原检测
更具体地，涉及一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组和方法。
技术介绍
腐烂茎线虫（DitylenchusdestructorThorne，1945）是一种迁移性的内寄生线虫，已知寄主120多种，主要为害甘薯和马铃薯，是农业上的重要病原线虫。在美国由于该线虫危害造成马铃薯产量的损失每年平均达10%。在中国，腐烂茎线虫病是制约甘薯生产的三大重要病害之一，近年来业已上升为北方甘薯产区最严重的病害，一般发病田块减产20%～50%，重病田块基本上绝产无收；在中国该线虫还危害当归、人参和三七等多种药材植物，危害当归严重时发病率高达84.9%。为了控制腐烂茎线虫的传播扩散导致更大的危害和损失，中国及其他国家和地区将其列为植物检疫性线虫。腐烂茎线虫种类的鉴定目前主要是利用形态学方法，主要是依据雌成虫的形态特征，通过高倍显微镜和扫描电镜观察获得形态特征信息，并与文献对腐烂茎线虫的形态描述进行比对分析，做出判定，而且卵、幼虫和雄虫均不适于形态学方法鉴定。此外，茎属线虫种类多，种间形态差异小，并且腐烂茎线虫还经常与其他类群线虫混合发生，运用形态学方法鉴定相似的茎属线虫种类或从多种混合的线虫中鉴定腐烂茎线虫非常困难，并且需要几天时间和多条线虫。因此研究和使用分子生物学方法快速准确的检测鉴定腐烂茎线虫是非常有必要的。目前，对于腐烂茎线虫的分子生物学鉴定，Wendt和宛菲均根据腐烂茎线虫rDNA-ITS区域设计了特异性引物，利用常规PCR技术进行分子鉴定（Wendt,1993;宛菲等,2008），该方法虽然具有准确、灵敏的特性，但是依然存在一定的局限性：（1）对于多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品，已有PCR检测方法需要先从样品中分离出目标线虫，然后才能进行检测，过程繁琐、工作量大；（2）其所述检测方法需要数小时，而且检测灵敏度较低，当样品中腐烂茎线虫含量较低时，无法实现目的；（3）需要用精密而昂贵的RCR仪，检测过程复杂，结果需要琼脂糖凝胶电泳检测才可以判定，不能满足口岸和调运检疫以及田间监测的需求。另外，环介导恒温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplicationofDNA,LAMP）是本世纪初开发的一种新型循环恒温核酸扩增技术。LAMP扩增过程依赖识别靶序列的6个独立区域，特异性强，灵敏度高，而且扩增速度快、对实验设备要求低、检测结果可以通过肉眼直观判断，因此该方法高效、快速、经济、操作简单，应用前景极为广泛。专利技术专利201110228196.6公开了一种基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒，针对甘薯腐烂茎线虫rDNA-ITS区设计了3组引物，可实现甘薯腐烂茎线虫的检测以及A型和B型的鉴定，解决常规分子检测成本高、效率低、速度慢，不能满足当前植物检疫和植物保护需要的难题。但是，该方案仍然没有解决多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品无法直接检测的问题，还是需要分离出样本中的线虫后再进行检测。而在实际的基层检测以及大批量筛查工作中，由于实验仪器设备的限制、人员能力的限制以及工作量大等因素的限制，亟需一种可以直接以样本总DNA为模板进行检测的技术。多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品等实物样品中都含有很多除目标DNA以外的其他杂质，尤其是土壤，是一个非常复杂的生态系统，包含有成千上亿种生物体，其中单就存在的线虫种类就非常之多，在一平方米土壤中的线虫种类多者可以达到一百多种；有时还可能会有组织细胞结构已被破坏的生物体残渣被作为有机肥料混入土壤中。这对实现直接特异检测出某一种线虫造成了非常大的困扰，另外，土壤中大量的微生物和环境之间存在着交互作用，在DNA提取过程中常伴随提取出一些腐殖性物质，将严重干扰检测过程。另外土壤中还存在很多未知的因素严重影响目标线虫检测的效果，这是本领域一直以来难以克服的难题。综上所述，目前包括腐烂茎线虫在内的植物线虫的实际检测工作中，最大的问题和障碍就是无法实现直接检测多种线虫混合的样品、植物组织样品、尤其是土壤样品等实物样品中的目标线虫，需要先从样品中分离出目标线虫，然后才能进行检测，过程繁琐、工作量大，不适用基层检测以及大批量筛查工作。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种不仅可以检测鉴定腐烂茎线虫不同虫态（卵、幼虫、雌虫和雄虫）的个体，还可以从多种线虫混合的样品、植物组织样品和土壤样品中直接快速检测出腐烂茎线虫的分子检测方法。且该方法准确、灵敏、高效、简便、快速。本专利技术的目的是提供一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组。本专利技术另一目的是提供一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组，包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQIDNO.1～5所示。其中，优选地，所述复杂样本为多种线虫混合的样品、植物组织样品或土壤样品。一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP方法，以待测样品DNA为模板，利用上述LAMP引物组进行LAMP扩增；根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫。优选地，所述LAMP扩增的体系如下：10×IsothermalAmplificationBuffer2.5μLF3/B3(5μM)1μLFIP/BIP(5μM)7μLLF(10μM)1μLdNTPs(10mmol/L)2μLMgSO4(100mmol/L)1.5μLBstDNA聚合酶2.0warmstart(8U/μl)0.2μL模板DNA1μLddH2O补足25μL。优选地，所述LAMP扩增的反应条件为：在65℃温育50min以上，85℃保温5min。另外，所述根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫的具体方法为：利用电泳检测法或荧光染料目测检测法对LAMP扩增进行检测。所述电泳检测法：使用2%琼脂糖凝胶在5～10V/cm电压下电泳35min检测LAMP扩增产物，出现LAMP特征性阶梯状条带，判定为阳性，即为有腐烂茎线虫；若未出现梯状条带，则为阴性，判定待测样品不含有腐烂茎线虫。所述荧光染料目测检测法：在LAMP扩增产物中加入2μL100×SYBRGreenI染料，可观察到绿色荧光，判定为阳性，即为有腐烂茎线虫；若观察到橙色，则为阴性，判定待测样品不含有腐烂茎线虫。另外，上述LAMP引物组或所述LAMP方法在检测和/或鉴定腐烂茎线虫中的应用，优选地是指在从复杂样品中检测和/或鉴定腐烂茎线虫中的应用，以及在制备腐烂茎线虫的检测鉴定试剂或试剂盒方面的应用，都应在本专利技术的保护范围之内。一种含有上述LAMP引物组的从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP试剂盒，也在本专利技术的保护范围之内。所述复杂样品包括混合线虫样品、植物组织样品和/或土壤样品。优选地，所述试剂盒还含有SYBRGreenI染料。优选地，所述试剂盒还含有LAMP扩增所需试剂。如10×IsothermalAmplificationBuffer、10mmol/LdNTPs、100mmol/LMgSO4、8U本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQ ID NO.1～5所示。

【技术特征摘要】
1.一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP引物组，其特征在于，包括一对外引物F3/B3、一对内引物FIP/BIP和一条环引物LF；序列依次如SEQIDNO.1～5所示。2.根据权利要求1所述的LAMP引物组，其特征在于，所述复杂样本为多种线虫混合的样品、植物组织样品或土壤样品。3.一种从复杂样本中快速检测腐烂茎线虫的LAMP方法，其特征在于，以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述LAMP引物组进行LAMP扩增；根据扩增结果判断待测样品中是否含有腐烂茎线虫。4.根据权利要求3所述的LAMP方法，其特征在于，LAMP扩增的体系如下：10×IsothermalAmplificationBuffer2.5μLF3/B3(5μM)1μLFIP/BIP(5μM)7μLLF(10μM)1μLdNTPs(10mmol/L)2μLMgSO4(100mmol/L)1.5μLBstDNA聚合酶2.0warmstart(8U/μl)0...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐春玲，丁善文，韩玉春，赵立荣，谢辉，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44