基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，包括以下步骤：将一面接种有成纤维细胞另一面接种有角质细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入CnT‑07 epidermal keratinocyte medium和DMEM（含10%体积比FBS、1%体积比的青霉素‑链霉素）这两种培养基，分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养和细胞增殖。本发明专利技术中构建方法通过利用干细胞分化技术得到所需细胞，在纳米结构上进行细胞的接种，在器官芯片中实现角质细胞和成纤维细胞的共培养，以用于表皮组织修复成为现在的研究热点和药物模型建立的新方法。

Targeted differentiation of 3D based on directional differentiation of organ chips and induced pluripotent stem cells

The present invention relates to a method based on the directional differentiation of an organ chip and induced pluripotent stem cells for the construction of a 3D pseudo epidermis. The following steps are included: placing one side of a 3D spinning frame with a keratinocyte on the other side of a fibroblast and placing it in a sterilized organ chip and entering the CnT epidermal 07 epidermal keratinocyte mediu M and DMEM (including penicillin with 10% volume ratio of FBS and 1% volume ratio of penicillin), respectively, cultured keratinocytes and fibroblasts to achieve co culture and cell proliferation of keratinocytes and fibroblasts. In this invention, the method of constructing the cells by using stem cell differentiation technique, inoculating the cells on the nanostructure, co culture the keratinocytes and fibroblasts in the organ chip, so as to make the epidermal tissue repair a new research hotspot and a new method for the establishment of the drug model.

【技术实现步骤摘要】
基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法。
技术介绍
皮肤是人体最大的器官，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，人的皮肤主要有表皮、真皮和皮下组织三层组成，在表皮层中含有可分化为形成角质层的角质细胞，真皮层中含有成纤维细胞，可分泌出多种大分子物质如胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖等。在日常生活中，皮肤受损和皮肤疾病不可避免，因此，需要大量且耐用的皮肤代用品来对受损的表皮进行修复，同时建立表皮疾病模型来进行给药研究，确定药物对表皮疾病的适用性。因此目前表皮组织的建立和表皮疾病模型的建立都需要角质细胞和成纤维细胞这两种细胞材料。诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells,iPSC）最初是日本科学家山中伸弥（ShinyaYamanaka）于2006年在《Cell》中发表了利用病毒载体将四个转录因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞和胚胎APSC多能细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，包括以下特征步骤：将一面接种有成纤维细胞另一面接种有角质细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入CnT‑07和DMEM培养基，分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养和细胞增殖，该DMEM培养基含有含10% 体积比的FBS和1%体积比的青霉素‑链霉素。

【技术特征摘要】
1.一种基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，包括以下特征步骤：将一面接种有成纤维细胞另一面接种有角质细胞的3D纺丝支架放置于灭菌后的器官芯片中，通入CnT-07和DMEM培养基，分别培养角质细胞和成纤维细胞，实现角质细胞和成纤维细胞的共培养和细胞增殖，该DMEM培养基含有含10%体积比的FBS和1%体积比的青霉素-链霉素。2.根据权利要求1所述基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，其特征在于：所述3D纺丝支架是通过以下方法制得，首先，利用L-edit软件进行图案设计，设计的薄膜尺寸为1×1厘米，然后根据设计的图案在硅片上进行负光刻胶匀速甩胶，之后进行前烘操作，再在紫外光刻机下曝光处理；随后经过后烘、显影得到具有微凹槽阵列的模板；其次，按照10:1的比例配置PDMS预聚物和交联剂，所得溶液倾倒于上述模板中，静置5分钟后，在80℃条件下烘2小时，最后经剥离得到3D微柱模板；然后，将打孔后的3D微柱模板贴合在玻璃片上，配制含有5%安息香双醛的PEGDA溶液，适量注入在模板和玻璃片之间，并在紫外光刻机下曝光处理，经剥离后得到微孔薄膜；再，配制15%的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)纺丝溶液，称取1.2gPLGA固体于20ml小玻璃瓶中，随后分别用量筒量取9mlN，N-二甲基甲酰胺(DMF)与3ml的四氢呋喃(THF)，并依次加至玻璃瓶中，静置过夜得10%PLGA纺丝溶液；最后，使用体积为20ml的注射器吸取上述所得的10%PLGA溶液并倒置放置10min以除去（除去）溶液中的气泡，设置流速为0.3ml/h，再将其固定在静电纺丝机中，将所述微孔薄膜放置在接收板上，设置纺丝时间8min，得到所需纳米纺丝支架。3.根据权利要求1或2所述基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，其特征在于：所述角质细胞是由经培养的iPSC分化而来，具体步骤如下，i、在接种密度为30%左右的iPSC贴壁的第二天，加入2mlDKSFM培养基，该DKSFM培养基含1um的all-transRA、10ng/mlHumanBMP4和1.5mmCaCl2，每两天换液一次，37℃、5%CO2培养箱培养；ii、在换三次液之后，吸除旧培养基，加入DKSFM培养基，该DKSFM培养基不含RA、BMP4和CaCl2，并每两天更换一次至角质细胞初步分化；iii、在步骤ii中换五次液后，吸除旧培养基，加入CnT-07培养基，每两天换液一次促进角质细胞增殖。4.根据权利要求3所述基于器官芯片与诱导多能干细胞的定向分化用于3D拟表皮构建的方法，其特征在于：所述成纤维细胞是由经培养的iPSC分化而来，具体步骤如下，制备拟胚体EB，向AggrewellTM400中加入DMEMmedium，润洗后吸出，加入AggrewellTMmedium，离心1000rmp，5min，除气泡，用0.5mM的EDTA消化密度为80~90%贴壁的iPSCs，用PBS吹打细胞并离心，吸出上清液；之后，取出培养箱备用的AggrewellTM400，去除其中的AggrewellTMmedium，重新加入1ml含107cell/ml的iPSCs...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玮莹，肖婷昱，吴轩，曹一平，
申请(专利权)人：江汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42