本发明专利技术公开了一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用，本发明专利技术筛选出一株屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7，保藏编号为：CCTCC NO:M2017665，将该菌株与鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌有效菌进行复配后获得的微生物菌剂，可以在堆肥升温期大量生长繁殖，发挥降解抗生素的作用，达到降低畜禽粪便中四环素类抗生素的效果。此方法降解效果好、操作简单，为降解畜禽粪便中残留的四环素类抗生素提供了有效的方法。
A microbial agent for degrading tetracycline antibiotics and its application
The invention discloses a microbial inoculant for highly efficient biodegradation of tetracycline antibiotics and its application. The invention has screened a strain of Enterococcus faecium (Enterococcus Faecium) DTC7, and the preservation is numbered as CCTCC NO:M2017665, and the microbial bacteria obtained from the strain and the effective bacteria of Enterococcus, coultus and fecal Enterococcus are obtained. The agent can grow and propagate in a high temperature during composting, and play the role of degrading antibiotics, so as to reduce the effect of tetracycline antibiotics in livestock manure. This method has good degradation effect and simple operation, and provides an effective method for degrading tetracycline antibiotics in livestock manure.
【技术实现步骤摘要】
一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用
本专利技术涉及畜禽粪便无害化
，具体而言，涉及一种高效降解四环素类抗生素的微生物菌剂及应用。
技术介绍
四环素类是一种广谱抗生素，包括四环素、金霉素、土霉素和强力霉素。四环素类对大多数革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及立克次氏体、支原体、衣原体等病原微生物都有很好的抑制作用。四环素以其优秀的促生长效果和低廉的价格在饲料和药物在猪的饲养环节中大量使用。四环素类抗生素在畜禽养殖业中的广泛使用使得四环素大量残留于畜禽粪便中。而抗生素不能完全被畜禽机体吸收，其30％-90％以母体化合物的形式排放至粪便中。猪粪或有机肥中残留的抗生素可以进入土壤中，随着雨水等自然界的水循环留在土壤表面；同时四环素类抗生素可以通过垂直矩阵下降到浅层土壤，逐渐渗透进到浅层地下水，最后进入江、河等径流。甚至海洋中也发现了多种四环素类抗生素的残留。这些残留的抗生素破坏海洋的微生物平衡，导致海洋的生态系统的破坏。四环素类抗生素对机体有一定的毒害作用。研究表明，四环素的使用虽然不会直接造成大鼠体重下降，但是会导致其性激素的合成受到抑制，睾丸、附睾、精囊的生长发育受到影响，大鼠精子数及精子成活率都显著下降。四环素类抗生素还会引起肝脏脂肪细胞病变和内质网应激，诱发病理性脂肪肝。土霉素会与体内的过氧化物酶结合，改变过氧化物酶的二级结构导致过氧化物酶失活，从而影响生物个体的发育。四环素类抗生素在低浓度下有较高的生物积累，可通过水的转运和被动运输进入植物中，其在叶片中的残留浓度最高，它对种子、植物根部以及植物茎叶的发育均有影响，最终损害蔬菜品质。目前，已在多种蔬菜中检测到了四环素的存在。这些抗生素可以通过植物、动物的富集作用进入人体中，进而危害人体的健康。因此有必要对粪便中残留的抗生素进行处理。目前降解四环素类抗生素的主要方法有水解、氧化降解、电化学降解、植物降解以及微生物降解。但是现有的方法仍存在几处不足(1)水解等非生物方法降解不完全，会有差向异构体等中间代谢产物的残留。(2)生物降解中植物降解缓慢，而酶解对条件的要求苛刻，成本高。(3)堆肥过程中堆体温度高，耐高温的四环素类降解菌的研究目前仍未有报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种高效降解四环素类抗生素的菌株，所述菌株已于2017年11月6日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：屎肠球菌(EnterococcusFaecium)DTC7，保藏编号：CCTCCNO:M2017665，地址：中国武汉武汉大学。本专利技术的另一个目的在于提供了一种高效降解四环素类抗生素的微生物复合菌剂，包括屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌。本专利技术的最后一个目的在于提供了一种高效降解四环素类抗生素的细菌或复合菌剂在降解四环素类抗生素中的应用。为了达到以上目的，本专利技术采取以下技术措施：屎肠球菌(EnterococcusFaecium)DTC7的筛选：为申请人从华中农业大学实验猪场、天门、荆门等地的猪场猪粪中分离、筛选、鉴定得到，提取细菌DNA，PCR扩增16SrDNA序列，提交NCBI数据库进行比对，参照《伯杰氏系统细菌学手册》和《常见细菌系统鉴定手册》该菌符合屎肠球菌的生理生化特征，确定为屎肠球菌。屎肠球菌DTC7为革兰氏阳性，白色菌落，菌落较小，呈规则的半球型，最适生长温度为37℃，在50℃PH＝9的条件下仍能生长。所述菌株已于2017年11月6日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：屎肠球菌(EnterococcusFaecium)DTC7，保藏编号：CCTCCNO:M2017665，地址：中国武汉武汉大学。一种高效降解四环素类抗生素的微生物复合菌剂，包括屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌。以上所述的方案中，优选的，屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌；库特氏菌有效菌和粪肠球菌的有效菌含量均为108～109cfu/ml，四种菌按照体积比1:1:1:1进行混合。商品化的鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌或是文献报道的，均可与屎肠球菌DTC7混合成复合菌剂完成本专利技术。以上所述的方案中，优选的：所述鹑鸡肠球菌为鹑鸡肠球菌EnterococcusgallinarumHT34-7，参考(王怡婷,金东,杨晶,卢珊,濮吉,孟祥莉,张桂,徐建国；喜马拉雅旱獭源鹑鸡肠球菌的分离及其耐药性检测[J]；疾病监测；2016,31(05):380-386)所述库特氏菌Kurthia.sp.，参考(阮志勇,赵斌,王彦伟,宋金龙,赵秉强,李燕婷,孔德龙,刘艳伟,王慧敏,陈小蓉,刘小飞；一种库特氏菌及微生物菌剂和它们的应用[P]；北京：CN103789226A,2014-05-14。保藏编号为CCTCCNO：M2013507)所述粪肠球菌B10MDXEF-1，参考(马德星,马春丽,葛俊伟,张丽丽,高铭扬,王芬,张跃,黄宇辰；鸡源粪肠球菌分离株及其应用[P]；黑龙江：CN104774782A,2015-07-15。保藏编号为：CCTCCNO:M2014488)。一种高效降解四环素类抗生素的细菌或复合菌剂在降解四环素类抗生素中的应用，包括以屎肠球菌(EnterococcusFaecium)DTC7为有效成分，制备成降解四环素类抗生素药物中的应用。所述的四环素类抗生素包括但不限于：土霉素、四环素和金霉素。本专利技术的有益效果：本专利技术筛选出粪源抗生素降解菌，可以在堆肥升温期大量生长繁殖，发挥降解抗生素的作用，达到降低畜禽粪便中四环素类抗生素的效果。此方法降解效果好、操作简单，为降解畜禽粪便中残留的四环素类抗生素提供了有效的方法。具体实施方案本专利技术技术方案中，所述试剂，如未特别说明，均购自生化商店，所述技术方案如未特别说明，均为本领域的常规技术。实施例1：屎肠球菌DTC7的分离纯化与鉴定：申请人从华中农业大学实验猪场、天门、荆门等地的猪场猪粪中分离、筛选、鉴定得到。具体分离纯化方法为：称取猪粪样品5g于50ml离心管中，加水至50ml摇床200r/min43℃震荡2h，取上清液1ml分别接种于抗生素浓度为20μg/ml的含有四环素、金霉素、土霉素的LB液体培养基中。24小时后吸取100μl接种于含上述抗生素浓度为40μg/ml的LB液体培养基中。按上述方法每次接种抗生素浓度提高20μg/ml，重复接种直至培养至浓度为200μg/ml。将培养至200μg/ml的培养基吸取100μl重新接种于含抗生素200μg/mlLB培养基中，恒温震荡培养箱200r/min43℃震荡2h。将培养基稀释10-6-10-7倍后震荡混合均匀，吸取50μl均匀涂布于LB固体培养基中，43℃恒温培养箱培养24h，挑选出菌落大小、形状不同的菌株于LB固体培养基划线纯化，43℃恒温培养，重复5次。LB液体培养基：酵母浸出物5g，NaCl5g，胰蛋白胨10g，加双蒸水至1000mL，加盐酸或NaOH调pH值至7.0±0.05，高温灭菌，4℃保存。LB固体培养基：酵母浸出物5g，NaCl5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉12-18g，加双蒸水至1000mL，加盐酸或NaOH调pH值至7.0±0.05，高温灭菌，待温度降到60℃左右时，加入抗生素，混匀后倒入灭菌干燥的培养皿中，超净台内无菌凝固后封口膜封口，标注日期，4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的屎肠球菌，所述的屎肠球菌为：屎肠球菌(Enterococcus Faecium)DTC7，保藏编号：CCTCC NO: M2017665。
【技术特征摘要】
1.一种分离的屎肠球菌，所述的屎肠球菌为：屎肠球菌(EnterococcusFaecium)DTC7，保藏编号：CCTCCNO:M2017665。2.一种高效降解四环素类抗生素的微生物复合菌剂，包括屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库特氏菌和粪肠球菌。3.根据权利要求2所述的微生物复合菌剂，所述的屎肠球菌DTC7、鹑鸡肠球菌、库...
【专利技术属性】
技术研发人员：任竹青，赵晨光，赵鹏翔，罗文涛，杨磊，吴健，倪德斌，刘望宏，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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