西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体，所述侵染性克隆表达载体由西瓜花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明专利技术首次制备得到了能通过农杆菌浸润方法接种并稳定高效侵染甜瓜、西葫芦等寄主植物的西瓜花叶病毒侵染性克隆，该侵染性克隆同时还能高效表达外源蛋白。

【技术实现步骤摘要】
西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建与应用
本专利技术涉及植物基因工程
，具体涉及一种西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建与应用。
技术介绍
侵染性克隆是指具有侵染性的cDNA或是能通过体外转录产生具有侵染性的RNA(Boyer等，1994)。植物病毒的侵染性克隆可分为两种类型：一类是侵染性RNA，构建的含有全长病毒基因组的cDNA序列的载体，经线性化后，由相应的RNA聚合酶体外转录为具有侵染活性的RNA；另一类是侵染性cDNA，在花椰菜花叶病毒(Cauliflowermosaicvirus，CaMV)35S启动子控制下的病毒基因组cDNA，可以直接用于机械摩擦接种、基因枪接种或者农杆菌共浸润接种。西瓜花叶病毒(Watermelonmosaicvirus，WMV)是马铃薯Y病毒属(Potyvirus)主要成员之一，能够侵染西瓜、甜瓜和南瓜等多种葫芦科作物，以及部分茄科作物。近年来西瓜病毒病的发生呈上升趋势，我国大部分地区因西瓜病毒病造成的损失为30-50％，甚至绝产，由WMV引起的病毒病已经成为制约西瓜高产稳产最主要的因素之一。通过侵染性克隆可以利用反向遗传学的方法从DNA水平本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体，其特征在于，所述侵染性克隆表达载体由西瓜花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.一种西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体，其特征在于，所述侵染性克隆表达载体由西瓜花叶病毒全基因组通过同源重组的方式克隆到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上制备得到；所述西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示。2.权利要求1所述的西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)从感染西瓜花叶病毒的发病株中提纯病毒粒子，并提取病毒粒子中的RNA；(2)以步骤(1)的RNA为模板进行反转录，以反转录产物为模板，以SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列作为特异性引物进行PCR扩增，获得西瓜花叶病毒全基因组；(3)通过酶切连接方法将花椰菜花叶病毒的35S启动子克隆到pCambia0390载体上，获得含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体；(4)通过同源重组的方法将西瓜花叶病毒全基因组连接到含有花椰菜花叶病毒35S启动子的pCambia0390双元载体上，即得到西瓜花叶病毒侵染性克隆表达载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，反转录的反应程序为：将模板RNA、Oligod(T)18、随机引物、和RNasefreeH2O混合，65℃保温5min，迅速置于冰上冷却2min，瞬间离心；再加入HiScriptⅡBuffer、dNTP、逆转录酶和RNA酶抑制剂；25℃，5min；50℃，45min；85℃，5min；终止反应。4.根据权利要求2所述的构...

【专利技术属性】
技术研发人员：田延平，冀树娴，李向东，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37