本发明专利技术涉及一种具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2及其分离筛选方法和应用。本发明专利技术的菌株其分类命名为：(Lactococus lactis)HKS2，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2017296，保藏日期为2017年5月31日。该菌株分离自海南热带养殖海水和凡纳滨对虾胃肠道的混合物。本发明专利技术的乳酸乳球菌HKS2不具溶血活性，具有较好的疏水活性、较高的自凝聚率、较强人工胃肠液耐受能力、较强胆盐耐受能力，较好的抑菌能力，将本发明专利技术的乳酸乳球菌HKS2作为饲料添加剂投喂凡纳滨对虾，经过养殖试验验证它能较好地提高机体免疫力，促进对虾生长，且效果稳定，是一种具有良好应用前景的菌株。
【技术实现步骤摘要】
一种具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2及其分离筛选方法和应用
本专利技术属于菌种领域，涉及一种乳酸乳球菌，更具体地说，本专利技术涉及一种具有乳酸活性的海南土著乳酸乳球菌HKS2及其分离筛选方法和应用。
技术介绍
为了追求高效、快速的养殖效益，不断加大养殖密度，扩大养殖规模，导致水产动物生长速度下降，饵料系数增大，弧菌病等常见病害频发，并导致抗生素等化学渔药滥用。这不仅增加了养殖成本，而且对水产品的质量安全和人类健康构成了巨大威胁。因此，寻找一种高效、健康、安全的养殖方法已成为当前水产养殖技术的研究热点。应用微生态制剂拌料投喂具有促进水产动物生长、提高免疫力、抑制病原菌生长、成本低、无再污染等优点，已成为无公害水产动物健康养殖模式中的主要关注焦点之一。其中，乳酸菌(lacticacidbacteria，LAB)是目前水产动物养殖拌料投喂中最常用的菌种之一，而乳酸乳球菌(Lactococuslactis)属于乳酸菌，是一种厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性菌，对人和水产动物体及环境安全，能够大量产生乳酸、乙酸和甲酸，以及胞外水解酶类而促进水产动物对营养物质的消化吸收，也维持了水产动物消化道菌群的稳定，并且对环境具有较强的适应能力强、能在水产动物肠道快速定值的细菌。乳酸菌具有提高水产动物免疫力作用，乳酸菌通过在水产动物肠道内定植，产生乳酸、各种酶、细菌素的小分子物质微生态、过氧化氢以及降解氨基酸产生吡啶多胺衍生物，这些物质能够刺激水产动物作出免疫应答，使水产动物处于免疫活跃的状态，从而提高水产动物的免疫能力。乳酸菌对肠道菌群调节作用，水产动物的健康状况与肠道内的微生物具有密切关系，肠道中的微生物是水产动物内生态环境的重要组成部分，影响动物的许多机能。乳酸菌通过黏附素(S-层蛋白、脂磷壁酸、脂多糖、肽聚糖等)黏附在动物胃肠道的上皮细胞中，并定植在宿主的肠道中，在肠道黏膜表面形成一道“生物膜”的屏障。“生物膜”屏障有效的阻挡了其他有害菌在肠道表面的定植，从而使动物的肠道有害菌减少，菌群生态更稳定。乳酸菌黏附或者定植胃肠道道中，在肠道中占位，对其他有害细菌在胃肠道中生存形成细菌干扰。乳酸菌产生的有机酸，主要为乳酸、乙酸、丙酸等。能有效降低胃肠道的pH值，从而抑制了其他耐酸性不强的有害细菌在胃肠道中的存活。乳酸菌在胃肠道中产生的过氧化氢具有一定的杀菌作用。乳酸菌能够合成维生素(叶酸、维生素B12等)、各种消化酶(蛋白酶等)、γ-氨基酸、胞外多糖(夹膜多糖等)、共轭亚油酸，这些乳酸菌分泌物或合成产物能提供动物一定的营养物质，有助于动物对营养物质的消化吸收，促进动物的健康生长！相关研究研究表明乳酸菌在水产应用方面取得显著效果，Kongnum等研究表明，采用乳杆菌拌料投喂凡纳滨对虾6周后，对虾的免疫力增强，饲料转化率、增重率、成活率和对弧菌的抵抗力均得到提高。Dawood等研究表明，在饲料中添加乳杆菌和乳酸乳球菌投喂红鲷鱼56天，免疫指标和生长指标显著提升，饵料系数降低。苟小兰等研究发现，乳酸菌对嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)等致病菌均有明显的抑制作用。不同生长环境的地衣芽胞杆菌菌株对应于本地环境下的养殖水体净化具有较好的效果，而对异地环境则经常表现出净化效果差，净化效果不稳定等。目前，国内有关地乳酸菌微生态制剂的专利主要集中在肥料生产的发酵菌种和食品等方面，有关养殖饲料添加的乳酸乳球菌专利较少，更未见关于乳酸乳球菌海南岛地理种群的相关专利。
技术实现思路
本专利技术针对
技术介绍
中所指出的问题及现有技术存在的不足，本专利技术的第一目的在于提供一种具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2，本专利技术的另一目的在于提供上述具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2的分离筛选方法，本专利技术的还一目的在于提供上述所述乳酸乳球菌HKS2的应用，特别是用于养殖饲料添加剂投喂凡纳滨对虾。为了实现本专利技术上述第一个目的，本专利技术采用的技术方案为：一种具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2，其分类命名为：(Lactococuslactis)HKS2，已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，其保藏编号是：CCTCCNO:M2017296，保藏日期：2017年5月31日。本专利技术所述的乳酸乳球菌HKS2，是分别从海南文昌养虾场水域和海南热带活体凡纳滨对虾体内采集的海水和活体虾肠道样品中分离筛选获得的乳酸菌菌株。所述乳酸乳球菌HKS2菌无血细胞溶解性，具有较好的疏水活性，较高的自凝聚率，安全性高，且此菌还具有较强的产酸能力、人工胃肠液耐受能力、较强的胆盐耐受能力和较强的拮抗致病菌能力：对哈维氏弧菌、溶藻弧菌、无乳链球菌、迟缓爱德华菌均具有较强的抑制作用。将本专利技术所述的乳酸乳球菌HKS2作为饲料添加剂投喂凡纳滨对虾，经过养殖试验验证它还能够较好地提高机体免疫力，促进对虾生长，且效果稳定，为一种具有良好应用前景的菌株。本专利技术上述所述的乳酸乳球菌(Lactococuslactis)HKS2还具有如下性质：1、微生物学特征乳酸乳球菌HKS2是革兰氏阳性菌，菌株在MRS培养基上菌落为乳白色、扁平、表面粗糙、湿润、边缘整齐，37℃培养24h后的菌落直径为2～4mm，菌落形态如图1所示。2、16SrRNA分析利用16SrRNAITS序列的相应引物，上、下游引物序列各为：5ˊ-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3ˊ和5ˊ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ˊ对乳酸乳球菌HKS2进行PCR扩增，测序后分别获得1409bp的片段，在GenBank的登录号为MF037867，该菌的16srRNA基因序列如SEQIDNO：1所示。为了实现本专利技术的另一目的，本专利技术提供上述所述的乳酸乳球菌HKS2的分离筛选方法，所述方法主要包括以下步骤：(1)样品采集分别从海南文昌养虾场水域和海南热带活体凡纳滨对虾体内采集海水样品和活体虾肠道样品，采集的海水样品取少量待用；将活体虾肠道样品放入灭菌生理盐水中，剪碎虾肠道，震荡混合成虾肠道混合液；取少量混合液待用，整个操作过程均在超净台上进行；(2)样品菌株扩大培养将步骤(1)所述海水样品和虾肠道混合液分别接种至装有MRS液体培养基中，于30℃、180r/min，摇床中震荡培养24h；(3)菌株初步分离对菌株的分离和纯化采用平板划线法与涂布法相结合，取步骤(2)中培养后的菌液涂布至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基中，于30℃恒温箱中培养48h，对长有菌落的平板进行观察，挑取有明显溶钙圈的菌株，划线至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基，重复3以上次划线培养，直至平板上长出的菌落，形态特征完全一致，最终获得分离纯化的目的菌株；(4)菌株产酸筛选与保存挑取步骤(3)分离纯化后的目的菌株，接着划线至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基上，于30℃恒温箱中培养48h，用游标卡尺测量各菌株的溶钙圈大小，筛选溶钙圈较大的菌株，用50％甘油溶液保存于-20℃冰箱中。进一步的，所述乳酸乳球菌HKS2接种量为1％～2％，初始pH值为7.0～7.2。一种乳酸乳球菌HKS2在抑制溶藻弧菌生长中的用途。一种乳酸乳球菌HKS2在抑制无乳链球菌生长中的用途。一种乳酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017296，保藏日期：2017年5月31日，所述乳酸乳球菌HKS2菌16sRNA基因序列如SEQ ID No：1所示。
【技术特征摘要】
1.一种具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2，其特征在于：保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2017296，保藏日期：2017年5月31日，所述乳酸乳球菌HKS2菌16sRNA基因序列如SEQIDNo：1所示。2.一种根据权利要求1所述的具有乳酸活性的乳酸乳球菌HKS2的分离筛选方法，其特征在于：所述方法主要包括以下步骤：(1)样品采集分别从海南文昌养虾场水域和海南热带活体凡纳滨对虾体内采集海水样品和活体虾肠道样品，采集的海水样品取少量待用；将活体虾肠道样品放入灭菌生理盐水中，剪碎虾肠道，震荡混合成虾肠道混合液；取少量混合液待用，整个操作过程均在超净台上进行；(2)样品菌株扩大培养将步骤(1)所述海水样品和虾肠道混合液分别接种至装有MRS液体培养基中，于30℃、180r/min，摇床中震荡培养24h；(3)菌株初步分离对菌株的分离和纯化采用平板划线法与涂布法相结合，取步骤(2)中培养后的菌液涂布至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基中，于30℃恒温箱中培养48h，对长有菌落的平板进行观察，挑取有明显溶钙圈的菌株，划线至含0.5％～3％轻质CaCO3的MRS固体培养基，重复3以上次划线培养，直至平板上长出的菌落，形...
【专利技术属性】
技术研发人员：谢珍玉，文金顺，龙昊，章翔，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：海南,46
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