一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备和应用方法技术

本发明专利技术为一种α‑丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备和应用方法。该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS‑PEI)，表面再修饰有α‑丁酮酸(KA)，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275μmol/g，修饰的α‑丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0。本发明专利技术的微球制备工艺简单、成本较低，应用于蛋白质复性中，可辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取，且不会污染复性体系。

Chitosan microsphere grafted with polyethyleneimine modified by alpha butanone acid and preparation and application method thereof

The invention relates to a chitosan microsphere grafted with polyethylene glycol imine modified by alpha butanone acid, and its preparation and application method. The microspheres are chitosan microspheres (CS PEI) grafted on the surface of polyethylenimide (KA), and the surface is modified with alpha butanone acid (KA), in which the amount of polyethylenimide grafted on the microspheres is 918~1275 u mol/g by anion exchange capacity, and the amount of modified alpha butanone acid is 612~1860 mu mol/g, and the microspheres are equal to the anion exchange capacity. The electric point value is 5.5 ~ 10. The preparation process of the microspheres is simple and low in cost. It can be used in the refolding of protein, can assist protein refolding and adsorb protein, and will not pollute the complex system.

【技术实现步骤摘要】
一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备和应用方法
本专利技术属于生物
中的蛋白质复性技术，具体为一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球及其制备方法，以及在蛋白质复性中的应用。
技术介绍
随着基因重组技术的快速发展，以重组蛋白质为主要成份的基因工程药物已逐步占据医药领域的重要位置。但重组蛋白质在宿主细胞中的高表达常常导致其发生错误折叠和聚集，错误折叠和聚集的蛋白质不具有生物活性，必须在体外对其进行溶解变性使其肽链伸展，然后在合适的溶液环境下使其恢复其天然构型和生物活性。使蛋白质恢复其天然构型和生物活性的过程称为蛋白质的体外再折叠或复性。在蛋白质复性过程中，疏水作用引发的蛋白质分子内的折叠与分子间的聚集为动力学竞争过程，后者的发生会导致复性收率的降低。因此，如何有效地抑制蛋白质聚集，是实现高效复性的关键。传统的抑制蛋白质复性过程中的蛋白质聚集的方法有：稀释复性、可溶性添加剂辅助复性以及色谱复性等。稀释复性操作简单，但若复性系统混合不利，会使局部蛋白质浓度过高，从而引起蛋白质复性收率下降。可溶性添加剂辅助复性中，多数添加剂能够有效地抑制蛋白质聚集、提高复性收率，但是添加剂的加入往往会在复性体系中引入新的杂质，在后续的分离过程中必须去除。色谱复性可以同时实现目标蛋白质的(部分)分离纯化以及复性，还可以通过调节变性剂或添加剂的浓度来优化色谱复性过程。但是，色谱复性设备昂贵，且操作条件需要严格的优化和控制，才能达到较好的复性效果。近来有报道提出利用与蛋白质带有同种电荷的微球抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性的方法(Mono-sizedmicrospheresmodifiedwithpoly(ethylenimine)facilitatetherefoldingoflike-chargedlysozyme.ReactiveandFunctionalPolymers,2012,72(11):889-896)。该方法中与蛋白质带有同种电荷的微球能够诱导表面电荷分布不均的蛋白质分子以相反电荷朝向荷电微球表面的形式在微球表面附近发生定向排列。这种定向排列会增大蛋白质分子间的静电排斥作用，从而抑制蛋白质聚集、促进蛋白质复性。与传统的复性方法相比，与蛋白质带有同种电荷的微球辅助蛋白质复性方法操作简单、不会对蛋白质造成污染、微球回收方便且无需昂贵的大型设备。壳聚糖(Chitosan，CS)是一种无毒性的天然碱性多糖，分子中含有伯胺及羟基基团。聚乙烯亚胺(poly(ethylenimine)，PEI)是一种阳离子聚电解质，分子上含有大量伯胺、仲胺及叔胺基团，完全质子化时电荷密度可高达23.3mEq/g。按照中国专利技术专利(CN104258830B)所述方法，利用乳化交联法制备交联壳聚糖微球并对其表面进行醛基化，在表面醛基化的交联壳聚糖微球表面接枝聚乙烯亚胺制备得到接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球CS-PEI。该CS-PEI微球是一种阴离子交换微球，其表面的伯胺、仲胺及叔胺等弱碱性基团，可通过质子化而带正电荷，因此可以辅助在复性条件下带正电荷的蛋白质复性。但是，由于CS-PEI微球表面只含有弱碱性基团，只能通过质子化而带正电荷，所以在辅助带正电荷的蛋白质复性后不能对带正电荷的蛋白质进行吸附提取(静电吸附作用只发生在带相反种类电荷的物质之间)；而且，由于CS-PEI微球只含有弱碱性基团，所以也不能辅助在复性条件下带负电荷的蛋白质复性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对当前技术中存在的不足，提供一种α-丁酮酸(α-Ketobutyricacid，KA)修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球，并将其应用于蛋白质复性中，可辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取。该方法选用α-丁酮酸作为修饰剂，并通过对物料配比、浓度以及相关参数的研究，制备得到了一种既含有弱碱性基团又含有弱酸性基团的两性离子交换微球。本专利技术的技术方案为：一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS-PEI-KA)，该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS-PEI)，表面再修饰有α-丁酮酸(KA)，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275μmol/g，修饰的α-丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0。所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：将CS-PEI微球置于锥形瓶中，加入浓度为0.5～5g/L的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为80～100g/L，并用NaOH溶液调节体系pH值为4～6，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下反应6～8h；再将微球用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下离心水洗干净后，加入0.5～0.6g/LNaBH4溶液，使微球在体系中的浓度为80～100g/L，并用HCl溶液调节体系pH值为7～8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下反应12～24h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下离心水洗，得到α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS-PEI-KA)。所述的NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，HCl溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，用于辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取。首先要测定上述在不同制备条件下制备得到的CS-PEI-KA微球的阳离子交换容量和等电点值，将具备适宜等电点值的CS-PEI-KA微球加入到蛋白质复性缓冲液中，然后加入变性蛋白质溶液进行蛋白质复性，复性完成后，调节溶液pH值对蛋白质进行吸附提取。复性和吸附完成后离心收集微球，用NaCl溶液解吸并离心，收集上清液经透析脱盐后为蛋白质溶液，收集微球经离心水洗后可回收利用。所述的应用方法包括如下步骤：1)确定待复性及吸附提取的蛋白质的等电点值，然后将其与下一步将要使用的复性缓冲液的pH值相比；如果蛋白质的等电点值大于复性缓冲液的pH值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也大于复性缓冲液的pH值的微球；如果蛋白质的等电点值小于复性缓冲液的pH值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也小于复性缓冲液的pH值的微球；所述的复性缓冲液中含有1～2mol/L尿素、20～50mmol/LTris–HCl及1～3mmol/LEDTA，溶剂为去离子水，且pH值为7.0～9.0；2)将CS-PEI-KA微球加入到复性缓冲液中，使复性体系中微球浓度为100～150g/L；上述混合物置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下振荡预平衡直至温度恒定；然后向其中加入待复性的浓度为10～20g/L变性蛋白质溶液，使复性体系中蛋白质浓度为0.5～2g/L；混合均匀后，置于空气振荡器中，在转速为120～170rpm条件下复性3～12h，复性温度与此前复性缓冲液预平衡的温度相同；所述的变性蛋白质溶液的制备方法为：将蛋白质溶解于变性缓冲液中，使蛋白质浓度为10～20g/L，于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种α‑丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS‑PEI‑KA)，其特征为该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS‑PEI)，表面再修饰有α‑丁酮酸(KA)，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275μmol/g，修饰的α‑丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0。

【技术特征摘要】
1.一种α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS-PEI-KA)，其特征为该微球为表面接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS-PEI)，表面再修饰有α-丁酮酸(KA)，其中，微球上接枝的聚乙烯亚胺的量以阴离子交换容量计为918～1275μmol/g，修饰的α-丁酮酸的量以阳离子交换容量计为612～1860μmol/g，微球的等电点值为5.5～10.0。2.如权利要求1所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的制备方法，其特征为该方法包括以下步骤：将CS-PEI微球置于锥形瓶中，加入浓度为0.5～5g/L的α-丁酮酸溶液，使微球在反应体系中的浓度为80～100g/L，并用NaOH溶液调节体系pH值为4～6，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下反应6～8h；再将微球用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下离心水洗干净后，加入0.5～0.6g/LNaBH4溶液，使微球在体系中的浓度为80～100g/L，并用HCl溶液调节体系pH值为7～8，然后将体系置于空气振荡器中，在温度为25～30℃、转速为120～170rpm条件下反应12～24h；反应结束后，将微球用去离子水，在转速为5000～8000rpm条件下离心水洗，得到α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球(CS-PEI-KA)。3.如权利要求2所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的制备方法，其特征为所述的NaOH溶液的浓度为0.1～0.5mol/L，HCl溶液的浓度为0.1～0.5mol/L。4.如权利要求1所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，其特征为用于辅助蛋白质复性并对蛋白质进行吸附提取。5.如权利要求4所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球的应用，其特征为所述的应用方法包括如下步骤：1)确定待复性及吸附提取的蛋白质的等电点值，然后将其与下一步将要使用的复性缓冲液的pH值相比；如果蛋白质的等电点值大于复性缓冲液的pH值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也大于复性缓冲液的pH值的微球；如果蛋白质的等电点值小于复性缓冲液的pH值，则从所述的α-丁酮酸修饰的接枝聚乙烯亚胺的壳聚糖微球中选取等电点值也小于复性缓冲液的pH值的微球；所述的复性缓冲液中含有1～2mol/L尿素、20～50mmol/LTris–HCl及1～3mmol/LEDTA，溶剂为去离子水，且pH值为7.0～9.0；2)将CS-PEI-KA微球加入到...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨春燕，李博，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：天津,12