一种调节血小板活性的药物、筛选方法及其用途技术

本发明专利技术涉及一种调节血小板活性的药物组合物、试剂盒、其筛选方法和在预防或治疗血栓性血小板减少性紫癜等血小板生存期缩短相关疾病以及延长血小板体外保存时间中的应用。其中本发明专利技术公开了一种抑制血小板线粒体自噬的药物组合物，其可以抑制血小板中FUNDC1与LC3相互作用，抑制血小板线粒体自噬，保持血小板的活性，包括具有FUNDC1的LIR结构域的可穿膜寡肽。特别地，本发明专利技术还涉及一种以线粒体FUNDC1和LC3相互作用为靶点的药物筛选方法，通过所述方法可筛选出能够抑制FUNDC1和LC3相互作用并调节线粒体自噬和血小板活性的药物，该药物用于预防或治疗血栓性血小板减少性紫癜等血小板生存期缩短相关疾病或延长血小板体外保存时间，具有良好的临床应用前景。

A drug for regulating platelet activity, screening method and its use

The present invention relates to a drug composition, a kit, a screening method, and a method for screening the thrombotic thrombocytopenic purpura and other thrombocytopenic purpura such as thrombocytopenic purpura, and prolonging the preservation time of the platelets in vitro, as well as in the treatment of thrombotic thrombocytopenic purpura. The invention discloses a drug composition for inhibiting autophagy of platelet mitochondria, which can inhibit the interaction of FUNDC1 and LC3 in platelets, inhibit autophagy of platelet mitochondria, and maintain platelet activity, including a transmembrane oligopeptide with a LIR domain of FUNDC1. In particular, the invention also relates to a drug screening method targeting the interaction of mitochondrial FUNDC1 and LC3, which can be used to screen out drugs that can inhibit the interaction of FUNDC1 and LC3 and regulate mitochondrial autophagy and platelet activity. The drug is used to prevent or treat thrombotic thrombocytopenic purpura and other small blood. The survival time of the plate shortens related diseases or prolongs the in vitro storage time of platelets, so it has good clinical application prospects.

【技术实现步骤摘要】
一种调节血小板活性的药物、筛选方法及其用途
本专利技术属于血液病学范畴和生物制造领域，涉及调节血小板活性和延长血小板体外保存时间的药物和药物筛选方法。本专利技术还涉及该药物在保护血小板活性和延长血小板体外保存时间中的用途。
技术介绍
线粒体是控制细胞能量代谢的重要的细胞器，也是细胞凋亡的调控中心，在凋亡因子的刺激下线粒体通过释放细胞色素C等凋亡相关分子来启动细胞凋亡过程。同时，线粒体也是细胞自由基产生中心。鉴于线粒体在细胞生命活动中的这些重要作用，受损伤的或不需要的线粒体必须被有效清除，以保证细胞正常生命活动的进行。线粒体自噬(Mitophagy)就是这样一种通过自噬机制选择性清除受损伤或不必需的线粒体的过程。线粒体自噬还可能参与红细胞(哺育动物红细胞没有细胞核和线粒体)的发生和成熟过程。线粒体自噬的异常也可能与神经退行性疾病，糖尿病和肿瘤的发生有密切关系。线粒体上存在几种蛋白质受体，包括酵母Atg32以及哺乳动物系统NIX/BNIP3L、BNIP3和FUNDC1，都在线粒体自噬中直接发挥作用。NIX/BNIP3L、BNIP3和FUNDC1通过LC3互作区域(LIR)直接结合LC3(哺乳动物中Atg8同系物)进而激活线粒体自噬。FUNDC1，一个新的介导哺乳动物细胞线粒体自噬的受体分子，它定位在线粒体外膜上，并通过特有的LIR保守的结构域与自噬的关键分子LC3相互作用来介导低氧诱导的线粒体自噬。此前的研究显示，LC3与线粒体自噬受体FUNDC1之间存在重要的相互作用，后者存在一个LC3相互作用区(LIR)，这一相互作用对于线粒体自噬选择性过程必不可少。LIR保守结构域的突变或缺失能够抑制其与LC3的相互作用和线粒体自噬。深入的研究还表明Fundc1的磷酸化在线粒体自噬调控中发挥了关键作用。循环血液中的血小板是包含线粒体、内质网、溶酶体等细胞器的无核血细胞。血小板是参与止血、血栓形成、特别是动脉血栓形成的主要有形成份。近几年的研究发现，血小板作为起源于巨核细胞的一种无核细胞，同样表达死亡受体、半胱氨酸蛋白酶caspases及Bcl-2蛋白家族等凋亡调控蛋白，可发生凋亡，血小板寿命降低。现有国内外临床上只是从抑制血小板凋亡的角度提高血小板体外保存时间。目前，针对线粒体自噬和血小板功能之间的报道并不多见，曾报道过抑制细胞自噬性降解会减弱血小板的聚集和粘附功能，申请号为CN200780033800.1中曾公开了多种增强或保持血小板的生存能力或寿命期的方法，该方法包括施用对细胞凋亡进行负调控的制剂。但对血小板中线粒体自噬的调控的药物用于血小板体外储存期或调控血小板活性的应用未见报道，且由于线粒体自噬和血小板生存期的现象和分子机制未知，因此通过调控细胞线粒体自噬，筛选影响血小板体外储存期或血小板活性的药物，将有利于开发具有临床应用价值的新型药物。
技术实现思路
基于以上问题，本专利技术研究发现，在血小板发生凋亡前，血小板功能特别是其线粒体功能都已发生了功能障碍，导致血小板功能大大降低，进而引起其储存期大大缩短。因此，本专利技术从另一全新角度提高血小板的体外保存质量和时间，大大提高医用血小板体外储存期和保护血小板活性。本专利技术一方面公开了一种保持或调节血小板活性的药物组合物，其中，所述药物组合物包括能抑制血小板线粒体自噬的药物和药学上可接受的载体。所述能抑制血小板线粒体自噬的药物包括肽、抗体或小分子化合物。优选地，所述的药物能抑制FUNDC1与LC3相互作用。所述的肽包括FUNDC1的LIR结构域Y18xxL21，优选地，所述的肽包括与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％以上的同源性或与之相同的肽，SEQIDNO:1QDYESDDDSYEVLDLTE；SEQIDNO:2QDYESDDESYEVLDLTE。本专利技术中，所述的肽还包括穿膜糖蛋白寡肽或其修饰物、衍生物。所述的穿膜糖蛋白寡肽优选为HIV-1TAT、penetratin、MAP、transportan/T10、VP22、polyarginine、MPG、PEP-1、pVEC、YTA2、YTA4、M918或CADY。优选地，所述的肽包括与SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％以上的同源性或与之相同的肽，SEQIDNO:3GRKKRRQRRRPQDYESDDDSYEVLDLTE；SEQIDNO:4GRKKRRQRRRPQDYESDDESp-YEVLDLTE。本专利技术中，所述的肽还包括哺乳动物来源的，优选地包括LIR基序第9个至第25个氨基酸残基。更优选地，所述的肽是非磷酸化的。本专利技术第二方面公开了一种调节血小板活性的试剂盒，其中，所述试剂盒包括能抑制血小板线粒体自噬的药物和药学上可接受的试剂盒组件，所述药物优选包括如前所述的药物，优选地，所述试剂盒用于延长血小板体外保存时间。本专利技术第三方面公开了治疗或预防血小板生存期缩短相关疾病或延长血小板体外保存时间的方法，包括施与能抑制血小板线粒体自噬的药物，所述的药物优选如前所述的药物。所述血小板生存期缩短相关疾病优选血栓性血小板减少性紫癜、血小板破坏增多性疾病、血小板消耗过多性疾病、血栓性疾病、癌症、胰腺炎、神经退行性疾病、炎症性疾病、感染疾病或细胞内病原体引起的感染本专利技术第四方面公开了诊断血小板生存期缩短相关疾病的方法，优选采用能够检测FUNDC1和LC3之间相互作用的试剂，优选所述试剂检测FUNDC1的LIR的磷酸化，所述血小板生存期缩短相关疾病优选血栓性血小板减少性紫癜、血小板破坏增多性疾病、血小板消耗过多性疾病、血栓性疾病、癌症、胰腺炎、神经退行性疾病、炎症性疾病、感染疾病或细胞内病原体引起的感染。本专利技术第五方面公开了筛选治疗或预防血小板生存期缩短相关疾病的药物的方法，其中，所述筛选方法包括测试候选药物调节血小板线粒体自噬和血小板活性，优选测试候选药物抑制血小板中FUNDC1和LC3之间相互作用或抑制AMPK激活的活性，优选所述方法是体外实施的。本专利技术还公开了以上药物组合物或筛选方法获得的药物。专利技术的有益效果本专利技术的有益效果在于本专利技术所述的肽可特异性地抑制血小板中FUNDC1与LC3相互作用和线粒体自噬，保护血小板活性和延长血小板体外储存时间。它们具有良好的药物开发潜力。其中，所述肽分子量较小，对哺乳动物的免疫原性低，可直接用于哺乳动物上。该分子结构稳定，易于合成与纯化，可大量生产，具有广阔的产业化前景。附图说明图1示出Fundc1基因敲除小鼠的构建和鉴定(a)Fundc1基因敲除小鼠的构建方案。(b)使用PCR和免疫印记实验对Fundc1基因敲除小鼠进行鉴定。(c,d)血细胞技术分析。(e)使用噻唑橙处理，用流式细胞仪分析网织红细胞。(f)脾形态。图2示出缺氧会导致体内血小板中FUNDC1-依赖性的线粒体自噬(a)在缺氧环境中(8％氧浓度)分别处理Fundc1基因敲除小鼠和野生型小鼠72小时，收集经处理后的小鼠血小板，利用免疫印记实验检测自噬分子标记物蛋白(每一基因型中有28只小鼠)。(b)使用电镜(TEM)检测线粒体的自噬。比例尺：500nm。(c)来源于缺氧处理小鼠的血小板中的FUNDC1和LC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种保持血小板活性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括能抑制血小板线粒体自噬的药物和药学上可接受的载体。

【技术特征摘要】
1.一种保持血小板活性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括能抑制血小板线粒体自噬的药物和药学上可接受的载体。2.如权利要求1所述的药物组合物，其中，所述能抑制血小板线粒体自噬的药物包括肽、抗体或小分子化合物，优选所述的药物能抑制FUNDC1与LC3相互作用。3.如权利要求2所述的药物组合物，其中，所述的肽包括FUNDC1的LIR结构域Y18xxL21，优选所述的肽包括与SEQIDNO:1或SEQIDNO:2的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％以上的同源性或与之相同的肽，SEQIDNO:1QDYESDDDSYEVLDLTE；SEQIDNO:2QDYESDDESYEVLDLTE。4.如权利要求2-3任一项所述的药物组合物，其中，所述的肽包括穿膜糖蛋白寡肽或其修饰物、衍生物，所述的穿膜糖蛋白寡肽优选为HIV-1TAT、penetratin、MAP、transportan/T10、VP22、polyarginine、MPG、PEP-1、pVEC、YTA2、YTA4、M918或CADY，优选所述的肽包括与SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％以上的同源性或与之相同的肽，SEQIDNO:3GRKKRRQRRRPQDYESDDDSYEVLDLTE；SEQIDNO:4GRKKRRQRRRPQDYESDDESYEVLDLTE。5.如权利要求2-4任一项所述的药物组合物，其中，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈佺，张卫林，刘垒，杜蕾，王晓慧，王珺，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11