用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。所述的用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组由上游引物和下游引物组成。此外，本发明专利技术采用该DPO引物组结合实时荧光定量PCR方法，建立了一种特异、快速检测猪传染性胃肠炎病毒的DPO‑real time RT‑PCR检测方法，该方法简单、特异性强、灵敏度高，能够实现现有检测技术所无法完成的定量、快速、特异、敏感的结果判定。因此，本发明专利技术的提出为猪传染性胃肠炎病毒的快速准确检测提供了新的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
本专利技术涉及一种用于猪传染性胃肠炎病毒检测的引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用，特别涉及一种用于猪传染性胃肠炎病毒进行定性、定量检测的双启动寡核苷酸(DPO)引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用。本专利技术属于生物检测

技术介绍
猪传染性胃肠炎(Transmissiblegastroenteritis)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触性、急性消化道传染病。以呕吐，严重腹泻和脱水为特征，危害严重，是影响养猪业发展的主要病毒性传染病之一，且该病经常与猪流行性腹泻与猪轮状病毒混合感染。病猪和带毒猪是主要传染源，经粪便、呕吐物、乳汁、鼻液和呼出的气体排出病毒，污染饲料、饮水、空气、车辆、工具和环境，经消化道和呼吸道传染给易感猪，死亡率高，严重危害猪业发展。目前常用的临床诊断的方法包括病理学检查、血清学检测和RT-PCR检测等，例如王劭等(猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法的建立，王劭等，动物医学进展，2007，28(11)：12-16)公开了一种猪传染性胃肠炎病毒RT-PCR检测方法，但RT-PCR检测引物设计过程复杂，需要对引物参数进行反复优化，有时即使反复优化过后仍然避免不了非特异性扩增及引物二聚体的存在。而且特异性差，避免不了非特异性扩增的出现。为解决此问题，本专利技术利用双启动寡核苷酸引物，即DPO引物，通过对猪传染性胃肠炎病毒特异性N基因序列DNAMAN比对，选取其高特异性序列进行DPO引物设计，建立了猪传染性胃肠炎病毒DPOreal-timeRT-PCR检测方法，DPO引物特异性高，退火温度范围宽，避免了传统方法中反复优化反应的麻烦。本专利技术检测方法特异强、敏感高，显着提高了对猪传染性胃肠炎病毒的检测效率及其敏感性，为猪传染性胃肠炎病毒的检测提供了重要的技术支持。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能够特异的、灵敏的检测猪传染性胃肠炎病毒的DPO-realtimeRT-PCR检测方法。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：为建立特异、快速检测猪传染性胃肠炎病毒的DPO-realtimeRT-PCR检测方法，本研究针对测猪传染性胃肠炎病毒的N基因设计了一对双启动寡核苷酸(DPO)引物，建立了猪传染性胃肠炎病毒DPO-realtimeRT-PCR检测方法。试验结果显示，本专利技术方法的检测下限为2.21×101copies/ul，在40℃-65℃退火温度范围内均可高效扩增靶基因片段，表明该方法退火温度范围宽，同时DPO引物特异性强，PCR反应过程中不会产生非特异性扩增。利用该方法对采集的128份样品进行检测，共计检出65份猪传染性胃肠炎阳性样品，经国标法(SN/T1446-2010)复验，两者检测结果一致，显示了良好的实用性。本专利技术的一种用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组，其由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物以及下游引物的序列如下所示：上游引物：5’CTGTTCTTGCCGCACTTAAAAIIIIIGGTGTTGAC3’下游引物:5’TAGCTCCATAAAATCTTGTCACATCIIIIITACCTGCAG3’其中，I表示次黄嘌呤核苷。进一步的，本专利技术还提出了所述的引物组在制备检测或诊断猪传染性胃肠炎病毒的试剂中的用途。一种用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO-realtimeRT-PCR试剂盒，其含有本专利技术所述的引物组。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，还包括荧光染料、反应缓冲液、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶、阳性标准品、阴性对照以及无RNA酶水。在本专利技术所述的试剂盒中，优选的，所述的反转录酶为M-MLV，所述的阳性标准品为含有猪传染性胃肠炎N基因序列第32-212位的质粒。使用本专利技术所述的试剂盒检测猪传染性胃肠炎病毒时，按照以下步骤进行：(1)提取待测样本的总RNA(2)反转录对步骤(1)提取得到的总RNA进行反转录得到DNA模板；(3)荧光定量PCR检测利用阳性标准品作为对照，以步骤(2)得到的DNA为模板，使用本专利技术所述的引物组进行荧光定量PCR扩增，荧光定量PCR体系为：荧光定量PCR程序为：95℃10min，95℃15s，60℃1min，共进行35～40个循环。(4)标准曲线的制作利用一系列不同浓度梯度的阳性标准品为模板，按照步骤(3)进行荧光定量PCR扩增，以标准品拷贝数的对数做为X轴，Ct值做为Y轴自动绘制标准曲线；(5)样本中病毒含量的计算根据建立的标准曲线分别计算样本中病毒的拷贝数。相较于现有技术，本专利技术的有益效果是：本专利技术采用DPO引物结合实时荧光定量PCR方法，因为实时荧光定量具有线性检测范围大、检测速度快、通量高、封闭检测无污染、灵敏度高等诸多优点，已经在核酸拷贝数定量方面有了诸多临床应用，DPO引物具有退火温度范围广，特异性好，设计简单，避免优化反应条件等优点。基于上述问题的考虑，本专利技术将登录于Genbank中高度保守的猪传染性胃肠炎N基因序列大量比对筛选，最终确定高度保守区以设计DPO-realtimeRT-PCR引物。从基因水平去构建猪传染性胃肠炎标准质粒，进行标准曲线的建立，能够实现现有检测技术所无法完成的定量、快速、特异、敏感的结果判定。本专利技术建立的DPO-realtimeRT-PCR方法设计简单、特异性强、灵敏度高，为猪传染性胃肠炎病毒的快速准确检测提供了新的技术手段。附图说明图1为TGEV荧光定量PCR检测方法建立结果；图2为TGEV荧光定量PCR标准曲线建立结果；图3为TGEV荧光定量PCR灵敏度检测结果；注：1-7分别为2.21×107copies/ul-2.21×101copies/ul浓度的质粒标准品图4为TGEV荧光定量PCR特异性检测结果；1：TGEV-N阳性质控；2：TGEVcDNA；3～10：PRVcDNA、PEDVcDNA、BVDVcDNA、IBDVcDNA、IFNVcDNA、BRVDNA、FIPVcDNA、阴性对照；图5为Real-timePCR常规引物与DPO引物特异性比对结果；图5A中，1：TGEV-N3基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-N3基因/TGEV-DPO引物；图5B中，1：TGEV-N5基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-N5基因/TGEV-DPO引物；图5C中，1：TGEV-SN3基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-SN3基因/TGEV-DPO引物；图5D中，1：TGEV-SN5基因/TGEV-CG引物；2：TGEV-SN5基因/TGEV-DPO引物；图6为DPO引物与已发表引物特异性对比结果。A)TGEV-P引物；B)TGEV-DPO引物。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术做进一步的说明验证，所有实施例仅用于例证本专利技术，不限制本专利技术的保护范围。本领域技术人员知晓对于本专利技术权利要求内所做的更改或等效变更，均落入本专利技术的保护范围之内。实施例1用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组的设计与合成通过猪传染性胃肠炎病毒生物信息分析，确定了N基因作为本专利技术的目的基因。根据Genbank中登录的猪传染性胃肠炎N基因序列，使用DNAMAN比对诸多序列筛选出高度保守区，具体为编码本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组，其特征在于由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物以及下游引物的序列如下所示：上游引物：5’CTGTTCTTGCCGCACTTAAAAIIIIIGGTGTTGAC3’下游引物:5’TAGCTCCATAAAATCTTGTCACATCIIIIITACCTGCAG3’其中，I表示次黄嘌呤核苷。

【技术特征摘要】
1.用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO引物组，其特征在于由上游引物和下游引物组成，所述的上游引物以及下游引物的序列如下所示：上游引物：5’CTGTTCTTGCCGCACTTAAAAIIIIIGGTGTTGAC3’下游引物:5’TAGCTCCATAAAATCTTGTCACATCIIIIITACCTGCAG3’其中，I表示次黄嘌呤核苷。2.权利要求1所述的引物组在制备检测或诊断猪传染性胃肠炎病毒的试剂中的用途。3.一种用于猪传染性胃肠炎病毒检测的DPO-realtimeRT-PCR试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的引物组。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括荧光染料、反应缓冲液、dNTP、RNasin、随机引物、反转录酶、阳性标准品、阴性对照以及无RNA酶水。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的反转录酶为M-MLV...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐义刚，王紫微，王丽，周晗，唐丽杰，李一经，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23