一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法技术
【技术实现步骤摘要】
一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种通过转基因调高玉米抗旱性的方法。
技术介绍
玉米是重要的粮食作物和饲料作物，也是全世界总产量最高的农作物。随着饲料与工业需求的增加，玉米需求呈强劲地增长态势，当前中国已从玉米净出口转变为玉米净进口。至2011年，玉米的播种面积已超过水稻，成为中国第一大农作物品种(王全忠等，2016)。玉米生长中需水量较大，在整个生长周期内，一般需要至少2500mm的降水量，而且生长期内的需水量变化很大，除苗期可适当干旱(蹲苗)外，从拔节到成熟都应保证良好的水分供应(王士谦，2005)。我国每年种植的玉米面积中，受到干旱影响的面积占了大约60％，造成减产20％-30％(高志勇等，2016)。因此通过玉米抗旱的遗传和生理基础研究，挖掘抗旱相关基因资源，培育高抗旱性玉米品系，对我国玉米生产具有重要意义。染色质重塑是在维持基因组稳定性、染色质结构和表达调控中起关键作用。Kim等通过染色质免疫共沉淀(ChIP)分析发现，干旱胁迫可诱导RD29A和RD29B基因启动子处核小体密度降低和H3K4me3与H3K9ac...
【技术保护点】
一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通过将CHB101基因的编码区转入到玉米基因组中，然后利用Ubi启动子组成型表达CHB101基因，从而提高玉米的抗旱性。
【技术特征摘要】
1.一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，通过将CHB101基因的编码区转入到玉米基因组中，然后利用Ubi启动子组成型表达CHB101基因，从而提高玉米的抗旱性。2.如权利要求1所述的一种通过转基因提高玉米抗旱性的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、总RNA的提取：S11、取4叶期玉米叶片剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内，加入1mlTrizol，充分混匀，室温放置5-10分钟后，加入RNAisoPlus的1/5体积量的氯仿，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化，无分相现象后，再室温静置5分钟；12,000g4℃离心15分钟；S12、从离心机中小心取出离心管，吸取上清液转移至另一新的离心管中，切忌吸出白色中间层；S13、向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟后，12,000g4℃离心10分钟，小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g4℃离心5分钟后小心弃去乙醇；S14、室温干燥沉淀2～5分钟，使酒精完全挥发后，用10-15μlDEPC-H2O溶解RNA，视沉淀量而定；S2、反转录操作：S21、用DNaseI处理RNA，10μl反应体系包含：DNaseI1μl；DNaseIbuffer1μl；RNA10μg；DEPC-H2Oupto10μl；轻轻混匀后瞬时离心，室温放置15min后，加入1μl25mM的EDTA，65℃处理10min，使DNaseI失活；S22、在冰上于PCR管中加入以下试剂：0.5μg/μl的oligodTnV1μl；10mM/each的dNTPs1μl；去除DNA的RNA5μg；DEPC-H2Oupto12μl；轻轻混匀后，65℃处理5min后，迅速转移到冰上冷却2min；S23、在上述体系中加入：5×RTbuffer4μl0.1MDTT2μlRNaseInhibitor1μl37℃预热2min，加入M-MLVRTase1μl，37℃温浴50min，70℃处理15min，使酶失活后，反应产物加入40μl1×TE稀释，充分混匀，保存于-30℃备用；S3、以反转录产物为模板，通过PCR方法扩增获得玉米CHB101基因，得克隆的CHB101基因；所述克隆的CHB101基因CDS序列全长为2349bp，编码782个氨基酸组成的蛋白，编码的蛋白带有SWIRM和SANT保守结构域，以及一个zinc-binding结构域；S4、玉米染色质重塑蛋白基因CHB101的过表达载体构建在通用双元载体pCAMBIA3301基础上改造获得的遗传转化载体；首先将序列表SEQIDNO：4所示的玉米泛素基因启动子通过SacI和BamHI酶切位点插入pCAMBIA3301中，得到改造遗传转化载体p3301-Ubi；对p3301-Ubi载体用限制性内切酶SalI和NheI进行酶切，去掉CaMV35S启动子和GUS基因；将上述克隆所得的玉米CHB101基因用SalI和NheI消化并回收包含完成CHB101阅读框的DNA片段，在把该片段连入上一步的酶切后p3301-Ubi载体，得到CHB101基因的过表达载体p3301-Ubi-CHB101；S5、利用PDS-1000台式基因枪进行玉米幼胚转基因操作，具体步骤如下：1)材料选取：根据授粉时间，取授粉后11天玉米H99种子的幼胚，此时玉米幼胚长约2mm；2)冲洗玉米穗：加1滴Tween20，在清水下浸泡、冲洗30min，然后用75％的乙醇泡30min，再用无菌水冲洗三遍；3)预培养：将经过2)处理后的幼胚，胚轴向下，盾面向上，放在铺有滤纸的含有愈伤组织诱导培养基N6E的培养皿中，30个幼胚/培养皿；缠好封口膜，置于培养箱，28℃，暗培养3天；得到预培养后幼胚；4)高渗预培养：将预培养后幼胚转入含有N60SM培养基的培养皿中，28℃，暗培养，进行高渗处理8h，得到高渗预培养后幼胚；5)载体处理在高渗处理期间，灭菌Holder和阻挡网，在金粉子弹中加入5μl已等摩尔比预混好的混合载体DNA，混匀，准备好后放在冰上，得到包裹了质粒的金粉悬液；6)将所得的高渗预培养后幼胚放入基因枪，在载体膜上滴加步骤5)得到的包裹了质粒的金粉悬液，基因枪真空度27～28psi，用650psi和1100psi可裂膜各轰击一次，可裂膜至靶点距离：6cm/9cm；得到轰击后幼胚；7)将轰击后幼胚在N6SOM培养基上...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。