本发明专利技术属于医药技术领域，特别涉及一种三叶青综合提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。本发明专利技术从三叶青中提取得到三叶青综合提取物，经动物实验验证，可有效减轻CIA小鼠的足肿胀度，显著抑制CIA小鼠关节病变并表现出良好的治疗效果，从基因表达方面三叶青综合提取物可以抑制RORγt和RANKLmRNA基因的表达，从而防治类风湿性关节炎。
Application of comprehensive extract of Trifolium repens in preparation of drugs for prevention and treatment of rheumatoid arthritis
The invention belongs to the field of medicine technology, in particular to the application of a comprehensive extract of Trifolium repens in preparing medicine for preventing and treating rheumatoid arthritis. The invention obtained the synthetic extract of Trifolium from Trifolium, which can effectively reduce the foot swelling degree of CIA mice, inhibit the joint lesion of CIA mice and show good therapeutic effect. The expression of ROR gamma T and RANKLmRNA gene can be inhibited from the gene expression of Trifolium. Prevention and treatment of rheumatoid arthritis.
【技术实现步骤摘要】
三叶青综合提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用
本专利技术属于医药
，特别涉及三叶青提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。
技术介绍
三叶青别称三叶崖爬藤、蛇附子、石老鼠等，为葡萄科崖爬藤属草质藤本植物，全草均可入药，以地下块根和果实的药用效果最好。三叶青具有“清热解毒、抗炎镇痛、活血化瘀”功效。类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、进行性、侵袭性关节炎为特征的全身性自身免疫病。我国RA患病率为0.3％～0.5％，是造成我国人群丧失劳动力和致残的主要疾病之一，对个人和国家造成巨大的经济损失。因此，探索其发病机理及安全、有效的治疗手段是亟待解决的问题。中医对病因的认识是从直接观察和审证求因二种得来的。根据本病活动期多表现为手足关节肿胀疼痛、拒按、触之发热、晨僵、或有皮下结节，或口渴、咽痛、按赤等，舌质红暗、或紫、有瘀斑、瘀点，脉弦纫或涩数。类风湿关节炎活动期主要病因病机为感受风热、热毒之邪，或风寒湿入侵机体，郁久化热为毒，导致气血壅滞不通，痹阻脉络，在辨热毒瘀血痹阻时，最主要的表现为手足关节肿胀疼痛，触之发热及舌脉变化。临床上有的活动性类风湿性关节炎患者在热毒瘀血之象中还表现关节怕冷等症，此为阳气内郁所致。因关节为气血敷布薄弱之处，热毒痰血痹阻，阳气内郁不达关节，故出现关节怕冷等症。此时不要误认为是寒证。只要热毒得祛，气血流通，则关节怕冷之症可除。许多情况下，中医药可达到与西药相近的治疗效果，且可弥补西药较大毒副作用及停药后复发的不足。这正是中医药的优势所在，但中医对RA治疗药物的作用机理研究相对薄弱，因此如果在这方面的研究取得进展，将会揭示中药作用的较确切的作用机制，为中医中药治疗RA提供理论基础。由于中药成分的复杂性，作用机制难以明确，疗效难以控制，限制了其在临床上的应用。
技术实现思路
本专利技术公开了三叶青综合提取物的医药新用途，即三叶青综合提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。一种三叶青综合提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。本专利技术从三叶青中提取得到三叶青综合提取物，经动物实验验证，可有效减轻CIA小鼠的足肿胀度，显著抑制CIA小鼠关节病变并表现出良好的治疗效果，从基因表达方面三叶青综合提取物可以抑制RORγt和RANKLmRNA基因的表达，从而防治类风湿性关节炎。作为优选，所述的三叶青综合提取物的制备方法如下：取三叶青干燥块茎，打碎；取5000g三叶青，加入5-8倍重量质量浓度为60％-80％的乙醇溶液，浸泡1-2h，然后加热回流提取2-3次，每次2-3h，合并提取液，低温真空回收酒精，得到浓缩液；浓缩液用3-8L石油醚分3次萃取，将得到的石油醚层和水层分离，石油醚萃取液回收石油醚后得到石油醚提取液；分离的水层用3-8升乙酸乙酯分3次萃取，将乙酸乙酯层和得到的水层分离，乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯提取液；水层用2-6L正丁醇分3次萃取，将正丁醇层和水层分离，得到水层提取液和正丁醇萃取液，正丁醇萃取液回收正丁醇，得到正丁醇提取液，将石油醚提取液、乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液和水层提取液混合，冷冻干燥，得到三叶青综合提取物(SYQ)。作为优选，低温真空的条件是真空度-0.085MPa，温度40℃。本专利技术为三叶青综合提取物提供了一种新用途，也为防治类风湿性关节炎提供了一种新的药物来源。而且三叶青提取物制备方法简单，原料来源广泛，具有良好的开发前景。附图说明图1是RA小鼠后足厚度随给药时间变化曲线；图2是RA小鼠类风湿关节炎评分随给药时间变化曲线；图3是RA小鼠踝关节组织切片图；图4是三叶青综合提取物对RA小鼠血清中OPG含量影响比较图；图5是三叶青综合提取物对RA小鼠血清中IL-17含量影响比较图；图6是三叶青综合提取物对RA小鼠脏免疫细胞中IL-17和Th17(ROR-γt)mRNA表达影响对比图；图7是三叶青综合提取物对RA小鼠股骨头中OPG、RANKLmRNA表达影响对比图。具体实施方式下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例：1、三叶青综合提取物制备取三叶青干燥块茎，打碎。取5000g三叶青，加入6倍重量质量浓度为70％的乙醇溶液，浸泡1h，然后加热回流提取3次，每次2h，合并提取液，低温真空(真空度-0.085MPa，温度40℃)回收酒精，得到浓缩液。浓缩液用5L石油醚分3次萃取，将得到的石油醚层和水层分离，石油醚萃取液回收石油醚后得到石油醚提取液。分离的水层用5升乙酸乙酯分3次萃取，将乙酸乙酯层和得到的水层分离，乙酸乙酯萃取液回收乙酸乙酯后，得到乙酸乙酯提取液。水层用4L正丁醇分3次萃取，将正丁醇层和水层分离，得到水层提取液和正丁醇萃取液，正丁醇萃取液回收正丁醇，得到正丁醇提取液，将石油醚提取液、乙酸乙酯提取液、正丁醇提取液和水层提取液混合，冷冻干燥，得到三叶青综合提取物(SYQ)。2、实验分组及模型的制备将牛Ⅱ型胶原(collagentypeⅡ，CⅡ)溶于0.1M的冰醋酸，浓度为2mg·mL-1，在4℃下搅拌充分溶解，置4℃冰箱过夜，再与弗氏完全佐剂在冰水浴中1∶1充分混和乳化，制成CⅡ乳剂(即CⅡ浓度为1mg·mL-1)，置4℃冰箱保存备用。造模时每只小鼠于尾根部皮内注射CⅡ乳剂0.1mL，7天时在尾根部加强注射0.1ml，并对CIA模型进行评价。随机选取8只DBA/1小鼠作为正常对照组。将造模成功的CIA小鼠随机分为CIA模型组(CIA)、三叶青综合提取物组(SYQ)，每组各8只。在初次免疫后31d起，正常组和CIA模型组小鼠分别给予生理盐水0.2mL/10g·d灌胃，SYQ组给于40mg/Kg·d灌胃，连续给药8周。3、三叶青综合提取物(SYQ)对小鼠足肿胀的影响在小鼠培养期间，记录给药后小鼠后脚趾厚度，实验结果见图1。如图1所示，CIA组致炎后第1周～第8周后脚趾足肿胀度与正常组相比较明显增加(P﹤0.01)，在致炎后第3周达到峰值，其后逐渐平稳。与模型组相比，三叶青综合提取物于第3周可明显减轻CIA小鼠的足肿胀度。4、三叶青综合提取物对CIA小鼠关节评分的影响造模后第0到8周进行分级评分，采用关节分数评分法记录多发性关节炎病变的发生及严重程度，关节分数分为5级(0-4)。0级：无红肿，0分；级：足小趾关节红肿，1分；2级：趾关节、足跖部均红肿，2分；3级：踝关节以下均红肿，3分；4级：包括踝关节，全部红肿，4分。各个关节的累计积分，即为每只小鼠的关节炎指数。如图2所示，致炎后1周，各模型小鼠开始出现全身症状，表现为关节红肿、变形、尾部结节、行动不便。三叶青综合提取物组在第5周到8周可显著抑制CIA小鼠关节病变，表现出良好的治疗效果。5、三叶青综合提取物对CIA小鼠踝关节组织病理学的影响对小鼠连续给药8周后，①取材实验小鼠麻醉后腹主动脉取血处死，取下右膝关节、包括踝关节在内的整个右后足爪固定于4％的多聚甲醛内，备用。②踝关节组织的脱钙用4％的多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种三叶青综合提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种三叶青综合提取物在制备防治类风湿性关节炎药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的三叶青综合提取物的制备方法如下：取三叶青干燥块茎，打碎；取5000g三叶青，加入5-8倍重量质量浓度为60%-80%的乙醇溶液，浸泡1-2h，然后加热回流提取2-3次，每次2-3h，合并提取液，低温真空回收酒精，得到浓缩液；浓缩液用3-8L石油醚分3次萃取，将得到的石油醚层和水层分离，石油醚萃取液回收石油醚后得到石油醚提取液；分离...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹岗，吴鑫，寿旗扬，
申请(专利权)人：浙江中医药大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33
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