血液嵌合动物的制作方法技术

公开了在中型~大型的家畜动物中也能够制作经长时间维持以高比率保有源自人等异种动物的血液细胞的状态的血液嵌合动物的新型手段。根据本发明专利技术的保有源自异种动物的血液细胞的非人动物的制造方法包括将作为异种动物的造血系统细胞且改造了作用于造血系统的基因的功能的细胞移植至非人动物。作用于造血系统的基因例如为Lnk基因。根据本发明专利技术的方法，即使在以猪等中型~大型哺乳动物作为受体的情况中，源自异种动物的造血系统细胞的成活率也急剧提高，即使在出生后16月龄的情况下，血液的嵌合率也能够维持10%以上的状态。

Methods of making blood chimerism

It is also a new method for making hematopoietic chimeras that are maintained for a long time to maintain high ratio of blood cells from humans and other heterogeneous animals in medium-sized and large livestock animals. According to the invention, a method of manufacturing non-human animals that originates from blood cells of xenogeneic animals includes transplantation of cells as hematopoietic cells of xenogeneic animals and transformation of cells acting on the functions of hematopoietic system into non-human animals. The genes that function in the hematopoietic system are, for example, the Lnk gene. According to the method of the invention, even in the case of swine and other medium-sized ~ large mammals as a receptor in hematopoietic cells from heterogeneous animal survival rate also increases sharply, even in the case of 16 month old after birth, blood chimerism can maintain the state of more than 10%.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血液嵌合动物的制作方法
本专利技术涉及以高比率保有异种动物的血液细胞的血液嵌合非人动物的制作。
技术介绍
以高比率保有人的血液细胞的非人动物作为评价对药剂、疾病、病毒感染等的反应的评价系统是非常有前景的，期待其成为在医学·医疗领域的发展中非常重要的模型动物。迄今为止，向超级免疫缺陷小鼠移植人的造血干细胞从而制作以高比率保有人的造血细胞的血液人源化小鼠。在血液人源化小鼠的情况中，难以进行长期试验，此外，由于存在与人的解剖学、生理学上的特征不同的部分，因此期望用与人的类似点多的猪、非人灵长类来制作以高比率保有人血液细胞的动物。然而，迄今为止，用非人灵长类、中型~大型的家畜动物还无法制作以高比率保有人血液细胞的动物。作为人血液嵌合动物的制作方法，已知通过向免疫耐受状态的非人动物胎儿移植人造血干细胞，可以制作人血液嵌合个体（专利文献1）。其为本申请专利技术人等开发的技术，该方法中，即使在猪、绵羊等大动物的情况下，也能够制作保有人的血液细胞的血液嵌合个体。然而，造血干细胞的成活率低，血液的嵌合率为数个百分点以下。从出生后起造血干细胞的成活数开始减少，无法经长时间维持异种的血液细胞。此外，还报告了将使作为参与造血的基因的HOXB4基因过表达的人造血干细胞作为供体细胞而移植至绵羊胎儿的方法（非专利文献1），但该方法中，造血干细胞的成活率也不足10%，无法长期以高比率维持血液嵌合状态。另一方面，已知Lnk（也称为Sh2b3）是主要在造血系统细胞和淋巴组织中表达的细胞内衔接蛋白，对巨核细胞的增殖和成熟、造血干细胞的扩增和造血能力发挥抑制性作用。还已知下述技术：在胚胎干细胞中，通过敲除或敲低Lnk基因，从而促进向巨核细胞的分化，增大血小板的生产（专利文献2）。然而，破坏了Lnk基因的造血干细胞在异种动物中的成活性尚不明确。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2005-229802号公报专利文献2：日本特开2007-089432号公报非专利文献非专利文献1:AbeTetal.ExvivoexpansionofhumanHSCswithSendaivirusvectorexpressingHoxB4assessedbysheepinuterotransplantation.ExpHematol.39(1),47-54(2011)。
技术实现思路
专利技术要解决的课题本专利技术的目的在于，提供在中型~大型的家畜动物中也能够制作经长时间维持以高比率保有源自人等异种动物的血液细胞的状态的血液嵌合动物的新型手段。用于解决课题的手段本申请专利技术人等对通过向胎儿移植造血干细胞而制作血液嵌合动物的技术的条件进行深入研究的结果发现，通过将缺失作为主要在造血系统细胞和淋巴组织中表达的细胞内衔接蛋白的Sh2b3/Lnk的小鼠造血干细胞作为供体细胞而移植至猪胎儿，能够显著提高小鼠造血干细胞在猪中的成活率，即使在16月龄的情况下，也能够得到维持10%以上这一高血液嵌合率的血液嵌合猪。因此发现，通过在供体细胞中改造Lnk基因、作用于造血系统的其它适当基因的功能，能够大幅提高源自异种的供体造血系统细胞的成活率，能够制作经长期维持血液嵌合状态的非人动物，从而完成了本申请的专利技术。即，本专利技术提供保有源自异种动物的血液细胞的非人动物的制造方法，其包括：将异种动物的造血系统细胞移植至非人动物，前述造血系统细胞为改造了作用于造血系统的基因的功能的细胞。此外，本专利技术提供保有源自异种动物的血液细胞的非人动物，其中，源自异种动物且改造了作用于造血系统的基因的功能的造血系统细胞成活，在外周血中保有源自异种动物的血液细胞。进一步，本专利技术提供血液细胞的制造方法，其包括：从上述本专利技术的非人动物采集血液，并分离前述源自异种的血液细胞。专利技术效果通过本专利技术，能够提供长期维持高嵌合率的血液嵌合非人动物。根据本专利技术的方法，即使以猪等中型~大型哺乳动物作为受体的情况中，源自异种动物的造血系统细胞的成活率也急剧提高，即使在出生后16月龄的情况下，血液的嵌合率也能够维持10%以上的状态。以10%以上这一高比例稳定地保有异种动物的血液细胞的动物在非人灵长类和中型~大型的家畜哺乳动物中不存在制作例，通过本专利技术而能够首次提供。使用不呈现免疫缺陷症状的通常的非人动物而制作血液嵌合动物时，不需要超净间那样的特殊环境，能够在通常的饲养环境下在维持高嵌合率的同时进行饲养。以高比率保有异种动物的血液的血液嵌合动物能够用作药剂、疾病、病毒感染等的评价模型，对于药剂的筛选是有用的。此外，还研究了用猪等家畜动物制作人的移植用脏器的技术，认为以高比率保有人血液细胞的家畜动物对人细胞形成免疫耐受，因此认为，作为生产人的移植用脏器的情况也是适合的，此外还能够在人脏器的保存中有效应用。进一步，如果用大型动物制作以高比率保有人血细胞的血液嵌合动物，则能够大量生产人血液细胞，因此作为献血的替代技术也是非常有希望的。附图说明图1是实施例中制作的猪幼崽的45日龄时血液样品的通过流式细胞仪得到的解析结果。a为使用了抗小鼠CD45抗体的小鼠血液嵌合猪幼崽的血液样品的流式细胞仪的单参数直方图的一个例子。b是算出小鼠有核血细胞在血液样品中的全部有核血细胞中所占的比例的结果。c是检测小鼠血液嵌合猪幼崽的血液样品中的粒细胞和B细胞的双参数直方图的一个例子。d是检测小鼠血液嵌合猪幼崽的血液样品中的粒细胞和T细胞的双参数直方图的一个例子。图2是用PE标记的抗小鼠CD45抗体检测16月龄的猪幼崽的血液中存在的小鼠成熟白细胞的结果。图3是用FITC标记的抗小鼠Gr-1抗体检测16月龄的猪幼崽的血液中存在的小鼠成熟粒细胞的结果。图4是针对16月龄的猪幼崽的血液样品用小鼠CD45阳性细胞进行门控（gating）从而研究小鼠白细胞中的粒细胞的比例的结果。具体实施方式在根据本专利技术的血液嵌合非人动物的制造方法中，将改造了作用于造血系统的基因的功能的造血系统细胞移植至非人动物。造血系统细胞是与成为受体的非人动物不同的动物的造血系统细胞，可以是造血干细胞，也可以是造血前体细胞。通常是主要包含造血干细胞的细胞群。非人动物优选为中型~大型的哺乳动物，例如可以为中型~大型的家畜哺乳动物。作为中型~大型哺乳动物的具体例，可以举出包括猪、牛、山羊、绵羊、鹿、骆驼等偶蹄类、和马等奇蹄类的各种有蹄动物、以及猴子等，但不限定于这些。家畜动物典型而言可以为有蹄动物。在非灵长类中制作人的血液时，从与人的解剖学上的类似性等观点出发，可以特别优选地使用猪。异种动物只要是与接受造血系统细胞的移植的非人动物不同种类的动物，则没有特别限定，典型而言为哺乳动物、最优选为人。基因功能的改造是基因功能的抑制或促进。一般而言，在对造血系统发挥抑制性作用的基因的情况中，只要抑制该基因的功能即可，在对造血系统发挥促进性作用的基因的情况中，只要促进该基因的功能即可。“抑制基因的功能”是指在用于移植的造血系统细胞中，通过改造基因组上的该基因区域中的至少一部分等，使原本编码的mRNA或蛋白质的生成或累积降低或缺失，包括基因的功能的降低至功能的完全缺失。用于抑制特定基因的功能的基因改造方法在本领域广泛公知，只要是本领域技术人员，则能够适当选择执行。如果大致分类，有使基因的功能缺失的基因破坏法（敲除法）、和使基因的功能本文档来自技高网...

【技术保护点】
保有源自异种动物的血液细胞的非人动物的制造方法，其包括：将异种动物的造血系统细胞移植至非人动物，所述造血系统细胞为改造了作用于造血系统的基因的功能的细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.22 JP 2015-1245691.保有源自异种动物的血液细胞的非人动物的制造方法，其包括：将异种动物的造血系统细胞移植至非人动物，所述造血系统细胞为改造了作用于造血系统的基因的功能的细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述非人动物为中型~大型哺乳动物。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述非人动物为猪。4.根据权利要求1~3中任一项所述的方法，其中，所述异种动物为哺乳动物。5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，作用于造血系统的基因的功能的改造为该基因的功能的抑制。6.根据权利要求5所述的方法，其中，作用于造血系统的基因为Lnk基因。7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法，其中，所述造血系统细胞包含造血干细胞。8.保有...

【专利技术属性】
技术研发人员：普川一雄，伊藤哲也，上川舞，千代丰，中内启光，山崎聪，渡部素生，
申请(专利权)人：全国农业协同组合连合会，国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP