用于加速基因组编辑的单倍体诱导系制造技术

本文提供了使用含有靶向的核酸内切酶的单倍体诱导系来生成具有靶向的突变和/或基因组修饰的转基因或非转基因植物的材料和植物中方法。本文还提供。

Haploid induction lines for accelerating genome editing

In this paper, haploid induction system containing targeted endonuclease is used to produce targeted mutagenesis and / or genome modification of transgenic or non transgenic plants. This article also provides.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于加速基因组编辑的单倍体诱导系相关申请的交叉参考本申请要求2015年6月30日提交的美国临时申请号62/186,913和2016年4月6日提交的美国临时申请号62/318,913的优先权。
本文涉及使用含有靶向的核酸内切酶的单倍体诱导系以产生在植物中(inplanta)具有靶向的突变的加倍单倍体植物的方法。所述方法可用于例如，玉米，小麦，燕麦，大麦，黑小麦和使用单倍体诱导系的其他物种，以及拟南芥和可以使用转基因单倍体诱导物方法产生单倍体的其他物种。该方法可用于产生转基因或非转基因加倍单倍体植物。
技术介绍
传统的植物育种策略已经开发了多年，以将期望的性状引入到植物物种中，例如高产量，抗病虫害，疾病和/或干旱，或适应特定的环境和生长条件。这类策略一般需要连续多轮的杂交，并且因此可能花费多年才能成功改变特定植物性状。随着转基因技术(也称为“分子育种”)的出现，通过引入转基因构建体或特定的核苷酸序列改变来通过基因组改变工程改造植物变得可能，从而为作物研究和改良提供了额外的工具。植物的遗传修饰可以通过向植物中加入一种或多种特定基因，或通过敲减基因表达(例如，用RNAi)来实现，以产生所需的性状。由于大部分植物基因组没有被遗传修饰改变，因此可以较快地生产修饰的植物。为了通过添加基因来遗传修饰植物，例如，设计构建体以在植物中表达基因-通常包括感兴趣基因，驱动基因转录的启动子和终止基因转录的终止序列。携带感兴趣基因的构建体通常伴随有用于选择转化的植物的选择标记(例如，抗生素或除草剂抗性基因)。可以使用，例如农杆菌(Agrobacterium)，粒子轰击或直接方法(例如显微注射)将构建体插入植物基因组中。在一些情况下，可以使用植物病毒将遗传构建体插入植物中。然而，转基因技术可能有缺点。例如，向基因组中插入转基因(如由粒子轰击介导)在很大程度上是随机的并且可能导致多次插入，这可能造成难以在分离期间追踪不同染色体上存在的多个转基因。此外，由于其染色体位置，转基因的表达可能是无法预测的，并且在一些情况中，转基因的表达是沉默的。另外，已经证明转基因植物的生产是非常有争议的话题，公众的观点通常是反对产生转基因变种，尤其是涉及的变种是将用作人类消耗的食物的作物植物时。基因组编辑是使用转基因的另一种方法。在这种方法中，可以引入转基因以在特定的DNA序列处产生突变，然后从基因组中去除转基因。例如，核酸内切酶转基因可以在随机位置被插入到基因组中，并被表达以产生蛋白质或RNA，其在基因组的第二位置处靶向并突变DNA的特定序列。转基因插入位点很可能不与突变的基因座连锁。因此，通过植物的异交可以将转基因从基因组中去除，或者如果转基因在植物系中不是纯合的，则可以简单地通过选择不含转基因的后代来去除转基因。因此，可以生产在特定DNA序列上具有突变且不含转基因的植物系。将突变引入作物品种(通常称为“原种系”)的传统方法可能是耗时且昂贵的。传统上，转基因修饰利用适合转化的系，但是这样的系通常不具有农学上的竞争性。因此，基因组工程改造的第一步通常是将核酸内切酶转基因转化入适合转化以产生所需突变的系。一旦该系发生了突变，其与农艺上竞争性的系(原种系)异交。突变的系和原种系之间的第一次杂交产生了“F1”植物，其中含有来自突变系的一半DNA和来自原种系的一半DNA。为了恢复具有所需突变的原种系的遗传背景，将F1植物与原种系(一种称为回交的过程)杂交以产生BC1F1植物。BC1F1含有来自原种系的大部分DNA，只有部分DNA来自突变系。回交过程重复两次，三次或更多次，直到恢复到足够百分比的原种系DNA组成。用分子标记物进行选择可以确保在最终的回交步骤中携带所需的突变。每一轮回交和分子标记物选择都增加了过程的成本和时间。此外，如果希望突变位于超过一个原种系中，则必须重复回交过程以将所需的突变引入其他原种系。概述本文至少部分基于开发基因靶向的植物有效的方法，其在一代中产生不含转基因的突变的，加倍的单倍体植物。该方法利用含有一种或多种核酸内切酶的植物单倍体诱导物贮备系以将(a)通过杂交进行单倍体诱导的步骤与(b)由核酸内切酶工程改造的靶向的DNA双链断裂的步骤合并，然后进行(c)染色体加倍步骤。具有单倍体诱导能力和核酸内切酶的植物可以同时诱导单倍体化和突变，因此被称为用于加速基因组编辑的单倍体诱导系(HILAGE)。这种基因靶向方法可以产生非转基因的、加倍的单倍体个体而不需要使用随后的回交过程，因此可能在植物生物学的许多领域具有显着的意义。例如，该技术可能会提高植物功能遗传学研究的速度。在一些情况下，本文提供的材料和方法可以用于产生对于外源核酸内切酶序列而言是非转基因的，但包含在目标位置处插入的转基因的植物。本文提供的方法也可以用于工程改造改良的植物性状，例如有商业价值的化合物的产量增加，改善的风味概况，谷物和/或生物质产量增加，营养品质提高，对生物和非生物胁迫的抗性和/或耐受性增加，农学性状改善，美学性状改善。本文提供的方法可以用于可以通过杂交产生单倍体个体的植物物种。利用携带核酸内切酶转基因的HILAGE系产生具有靶向的基因突变的加倍的单倍体个体的益处可包括，例如(i)在遗传背景下快速产生靶向的突变而不论背景的可转化性的能力；(ii)在植物中产生靶向的突变避免了缓慢且昂贵的整株植物转化，因为一旦转基因在HILAGE株系中则不需要进一步的整株植物转化；(iii)在得到的植物中保留极少或不存在HILAGE系的DNA，使得不需要将突变及时和昂贵地回交到原种系中，并且没有由含有非原种遗传物的最初转化的系的残余DNA引起的产量减阻；(iv)至少关于外源核酸内切酶序列，所得到的单倍体和加倍的单倍体植物的非转基因状态；和(v)通过向HILAGE贮备系添加更多核酸内切酶以便一次靶向超过一个基因的方法的易可放大性。除了每个系生成的突变数量的可放大性之外，该方法在每年可以突变的系的数量上也是高度可放大的。这些性质因此有助于成本有效和节省时间的方法，易于放大和广泛部署，并且可以容易地结合到当前的育种方法中。在本文中称为“HILAGE突变”或“HILAGE-MUT”的一个方面，本文描述了用于产生在所选DNA序列处或附近具有突变的加倍单倍体植物细胞的方法。在一些实施方式中，所述方法可以包括(a)用编码稀切核酸内切酶的核酸转化单倍体诱导系以产生其中稳定整合了所述核酸的HILAGE贮存系，其中编码稀切核酸内切酶的核酸与受精后的至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中稀切核酸内切酶靶向选择的DNA序列；(b)将HILAGE贮存系与靶向系杂交以产生含有该稳定整合的核酸的F1合子；(c)培养所述F1合子，使得(i)所述稀切核酸内切酶被表达并且在所选择的DNA序列处或附近切割染色体DNA，其中切割后染色体DNA的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除使来自HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；和(d)诱导单倍体细胞中的染色体加倍以产生含有突变的加倍的单倍体植物细胞。植物细胞可来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。所述稀切核酸内切酶可以是转录激活物样效应物(TALE)核酸内切酶，CRISPR/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生成加倍的单倍体植物细胞的方法，所述植物细胞在选择的DNA序列处或其附近包含突变，所述方法包括：(a)用编码稀切核酸内切酶的核酸转化单倍体诱导系以生成用于加速基因组编辑的单倍体诱导系(HILAGE)贮存系，其具有稳定整合到其中的核酸，其中所述编码稀切核酸内切酶的核酸与在受精后的至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所述选择的DNA序列；(b)将HILAGE贮存系与靶向的系杂交以生成包含所述稳定整合的核酸的F1合子；(c)培养所述F1合子，使得(i)所述稀切核酸内切酶被表达，并在所述选择的DNA序列处或其附近切割染色体DNA，其中切割后所述染色体DNA的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除，使得来自HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；并且(d)在所述单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有所述突变的加倍的单倍体植物细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.06.30 US 62/186,913;2016.04.06 US 62/318,9131.一种生成加倍的单倍体植物细胞的方法，所述植物细胞在选择的DNA序列处或其附近包含突变，所述方法包括：(a)用编码稀切核酸内切酶的核酸转化单倍体诱导系以生成用于加速基因组编辑的单倍体诱导系(HILAGE)贮存系，其具有稳定整合到其中的核酸，其中所述编码稀切核酸内切酶的核酸与在受精后的至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所述选择的DNA序列；(b)将HILAGE贮存系与靶向的系杂交以生成包含所述稳定整合的核酸的F1合子；(c)培养所述F1合子，使得(i)所述稀切核酸内切酶被表达，并在所述选择的DNA序列处或其附近切割染色体DNA，其中切割后所述染色体DNA的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除，使得来自HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；并且(d)在所述单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有所述突变的加倍的单倍体植物细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。3.如权利要求1所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是转录激活物样效应物(TALE)核酸内切酶，CRISPR/Cas基核酸酶，锌指核酸酶(ZFN)或大范围核酸酶。4.如权利要求1所述的方法，其中启动子是花椰菜花叶病毒加倍增强35S启动子，玉米ZmUb1启动子，或水稻APX，OsCc1，EIF5，R1G1B，PGD1，Act1或SCP1启动子。5.如权利要求1所述的方法，其中所述修复包括同源重组。6.如权利要求5所述的方法，其中所述突变包括一个或多个核苷酸取代，添加，或缺失。7.如权利要求5所述的方法，其中所述突变包括插入转基因DNA序列。8.一种生成加倍的单倍体植物细胞的方法，所述植物细胞在选择的DNA序列处或其附近包含突变，所述方法包括：(a)用编码稀切核酸内切酶的核酸转化植物细胞系以生成具有稳定整合到其中的核酸的转基因植物细胞系，其中所述编码稀切核酸内切酶的核酸与受精后至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所述选择的DNA序列；(b)将所述转基因植物细胞系与单倍体诱导系杂交以生成HILAGE贮存系，所述HILAGE贮存系对于所述编码稀切核酸内切酶的核酸纯合并且其大部分DNA来自所述单倍体诱导系，其中所述HILAGE贮存系能在杂交后诱导单倍体；(c)将所述HILAGE贮存系与靶向的系杂交以生成包含所述稳定整合的核酸的F1合子；(d)培养所述F1合子，使得(i)所述稀切核酸内切酶被表达，并在所述选择的DNA序列处或其附近切割染色体DNA，其中切割后所述染色体DNA的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除，使得来自HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；并且(e)在所述单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有所述突变的加倍的单倍体植物细胞。9.如权利要求8所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。10.如权利要求8所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是TALE核酸内切酶，CRISPR/Cas基核酸酶，ZFN，或大范围核酸酶。11.如权利要求8所述的方法，其中启动子是花椰菜花叶病毒加倍增强35S启动子，玉米ZmUb1启动子，或水稻APX，OsCc1，EIF5，R1G1B，PGD1，Act1或SCP1启动子。12.如权利要求8所述的方法，其中所述修复包括同源重组。13.如权利要求12所述的方法，其中所述突变包括一个或多个核苷酸取代，添加，或缺失。14.如权利要求12所述的方法，其中所述突变包括插入转基因DNA序列。15.一种生成加倍的单倍体植物细胞的方法，所述植物细胞在选择的DNA序列处或其附近包含突变，所述方法包括：(a)将HILAGE贮存系与靶向的系杂交以生成F1合子，其包含稳定整合的核酸，其中单倍体诱导系包含稳定整合的编码稀切核酸内切酶的核酸，其中所述编码稀切核酸内切酶的核酸与受精后至少第一次和第二次细胞分裂期间在植物胚中表达的启动子操作性地连接，并且其中所述稀切核酸内切酶靶向所述选择的DNA序列；(b)培养所述F1合子，使得(i)所述稀切核酸内切酶被表达，并在所述选择的DNA序列处或其附近切割染色体DNA，其中切割后所述染色体DNA的修复导致所述突变，和(ii)发生基因组消除，使得来自HILAGE贮存系的染色体被消除，产生单倍体细胞；并且(c)在所述单倍体细胞中诱导染色体加倍以产生含有所述突变的加倍的单倍体植物细胞。16.如权利要求15所述的方法，其中所述植物细胞来自玉米，小麦，大麦，黑小麦，拟南芥，燕麦，青椒，番茄，马铃薯，大豆或荠蓝。17.如权利要求15所述的方法，其中所述稀切核酸内切酶是TALE核酸内切酶，CRISPR/Cas基核酸酶，ZFN，或大范围核酸酶。18.如权利要求15所述的方法，其中启动子是花椰菜花叶病毒加倍增强35S启动子，玉米ZmUb1启动子，或水稻APX，OsCc1，EIF5，R1G1B，PGD1，Act1或SCP1启动子。19.如权利要求15所述的方法，其中所述修复包括同源重组。20.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·W·坎贝尔，J·刘，R·M·斯图帕，
申请(专利权)人：明尼苏达大学董事会，
类型：发明
国别省市：美国,US