一种应用大肠杆菌胞外生产N‑糖基化重组蛋白的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体是一种大肠杆菌胞外生产N‑糖基化重组蛋白的方法。本发明专利技术方法主要步骤包括构建敲除大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp基因的大肠杆菌菌株、引入外源N‑糖基化机制到所构建的大肠杆菌中、构建质周腔中表达目的蛋白的载体及自动诱导方式表达目的蛋白，可实现利用大肠杆菌N‑糖基化修饰目的蛋白并实现N‑糖基化蛋白分泌到胞外。该方法降低了外源基因表达产物在质周腔过度积累所造成的代谢负荷，提高了N‑糖基化目的蛋白总产量；无需破碎细菌而从培养基中直接分离纯化N‑糖基化蛋白，简化了分离纯化步骤，易于大规模工业化生产。

Production method of N glycosylation of recombinant protein for extracellular application of Escherichia coli

The invention belongs to the field of biotechnology, in particular to a method for producing N glycosylation of recombinant proteins in Escherichia coli extracellular. The method of the invention comprises the following steps: to construct knockout Escherichia coli outer membrane protein Lpp gene into Escherichia coli strain, exogenous N glycosylation mechanism to construct Escherichia coli, vector protein and automatic induction expression of target protein expression in the interstitial week in the cavity can be realized using Escherichia coli N glycosyl modification of protein and N glycosylated protein excreted. This method reduces the expression of exogenous gene metabolic load caused by excessive accumulation of products in the periplasmic cavity, improves the N glycosylation protein production; without breaking the bacteria from the culture medium of direct separation and purification of N glycosylated protein, simplify the purification steps, easy to large scale industrial production.

【技术实现步骤摘要】
一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法
本专利技术属于生物
，具体是一种大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法。
技术介绍
近来应用大肠杆菌原核表达系统来生产糖蛋白日益受到重视。大肠杆菌具有基因组背景清楚、工程菌株构建简单快速、生长速度快、生产周期短、发酵成本低、产量高、适合大规模工业化生产等优点。目前，可以通过基因工程改造大肠杆菌菌株及将外源N-糖基化机制引入大肠杆菌，使其获得表达N-糖基化蛋白的能力。主要是将空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)糖基转移酶pglB及不同来源的糖基转移酶转到大肠杆菌体内，使其具有在大肠杆菌质周腔中N-糖基化修饰重组蛋白的能力，在此系统中只有在质周腔中才能实现N-糖基化修饰重组蛋白，所以重组蛋白须通过信号肽引导到质周腔中。而在质周腔中表达重组蛋白，表达量往往远远低于在大肠杆菌胞质内表达，所以导致N-糖基化的蛋白总量减少。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种应用基因敲除大肠杆菌外膜脂蛋白Lpp进行胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，可以显著提高重组N-糖基化蛋白的表达量，表达的N-糖基化重组蛋白直接分泌到培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种应用大肠杆菌胞外生产N‑糖基化重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株构建；(2)构建大肠杆菌质周腔中表达目的蛋白的载体，结合空肠弯曲杆菌N‑糖基化机制，得到能胞外生产N‑糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌；(3)步骤(2)中获得的能胞外生产N‑糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌在自动诱导培养基中诱导胞外生产N‑糖基化重组蛋白；(4)步骤(3)获得的重组蛋白纯化后即得N‑糖基化重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种应用大肠杆菌胞外生产N-糖基化重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)大肠杆菌W3110ΔWecAΔLpp菌株构建；(2)构建大肠杆菌质周腔中表达目的蛋白的载体，结合空肠弯曲杆菌N-糖基化机制，得到能胞外生产N-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌；(3)步骤(2)中获得的能胞外生产N-糖基化重组蛋白的重组大肠杆菌在自动诱导培养基中诱导胞外生产N-糖基化重组蛋白；(4)步骤(3)获得的重组蛋白纯化后即得N-糖基化重组蛋白。2.如权利要求1所述的一种应用大肠杆菌胞外生...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡学军，丁宁，阮瑶，付鑫，吴凡凡，王莉娟，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21