一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法技术

本发明专利技术提供了一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法，该方法包括两个阶段：第一阶段为体内刺激iNKT细胞增殖，使用特异性的刺激剂α‑Galcer刺激小鼠体内iNKT细胞增殖；第二阶段为体外定向诱导iNKT细胞扩增，取经α‑Galcer刺激的小鼠胸腺，制备单细胞悬液，并加入α‑Galcer、诱导剂以辅助iNKT细胞扩增并引导其分化。本发明专利技术采用体内刺激增殖与体外诱导扩增相结合的方法定向诱导iNKT细胞，实现了在短时间内获得大量定向分化并具有特定功能的iNKT细胞。有效地减少细胞体外扩增培养时复杂繁琐的步骤，缩短细胞培养的时间，可重复性强且成本相对较低。

A method of directed induced amplification of a thymic source of iNKT cells

The present invention provides a method for inducing a directional amplification of iNKT cells originated from the thymus, the method includes two stages: the first stage is to stimulate the proliferation of iNKT cells in vivo, proliferation of mouse iNKT cells stimulated in vivo using a specific stimulator of alpha Galcer; the second stage is set to induce iNKT cells amplification in vitro, from mouse thymus alpha Galcer stimulation, single cell suspension was prepared and added to Galcer, alpha inducer of iNKT helper cell amplification and guide its differentiation. The invention directionally induces iNKT cells by combining in vivo stimulation with proliferation in vitro, and achieves a large number of directional differentiation and specific functions of iNKT cells in a short time. It can effectively reduce the complex and complicated steps of cell expansion and culture in vitro, shorten the time of cell culture, and have a strong repeatability and relatively low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法
本专利技术涉及免疫学领域，具体地说涉及一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法。
技术介绍
iNKT细胞是一群兼具NK细胞功能和T细胞特点的特殊免疫细胞，是沟通适应性免疫和固有免疫的桥梁。iNKT细胞不同于传统的T细胞，其表面TCR缺乏多样性，抗原识别谱窄，可识别不同靶细胞表面CD1分子提呈的共有脂类和糖脂类抗原（a-Galcer），且不受MHC限制。iNKT细胞为固有免疫细胞，其主要生物学功能是细胞毒和免疫调节作用。iNKT细胞可作为免疫调节的中心与其他免疫细胞相互作用，在感染、肿瘤和自身免疫病发生发展中发挥着至关重要的作用。iNKT细胞是一个不均一的细胞群体，根据其转录因子的表达情况及主要产生的细胞因子水平的不同，主要分为iNKT1、iNKT2和iNKT17三个亚群。iNKT细胞既能控制和缓解糖尿病、肿瘤及器官移植的排斥的进展，又能扩大和促进红斑狼疮、过敏性哮喘等的发生和发展，这些相互矛盾的实验结果，推测是与不同亚群的iNKT细胞功能有关。鉴于功能和用途的多样性，iNKT细胞被誉为免疫系统的“瑞士军刀”。细胞免疫治疗是近年来新兴的一种生物治疗方法，通过输注体外诱导的自体细胞可以有效调控机体免疫系统的功能紊乱，在肿瘤、感染及自身免疫性疾病等多种疾病的治疗中发挥重要的作用。因此，获取特定的具有调节作用的免疫细胞用于细胞免疫治疗的研究具有重要的意义，而iNKT细胞作为免疫调控的中心，其对于细胞免疫治疗的意义不言而喻，iNKT细胞过继输注的细胞免疫治疗可以成为肿瘤、感染及许多免疫性疾病治疗的新战略。但是因其在体内数量少，频率只占到外周血单个核细胞总数的0.3%，严重限制了其在临床应用中的潜力，因此获取大量定向分化的iNKT细胞用于细胞免疫治疗成为当前研究的热点。目前文献中报道的诱导扩增iNKT细胞的方法有：1.将成熟的NKT细胞核转移至胚胎干细胞（ES），从而大量扩增NKT细胞。2.骨髓来源的成体造血干细胞（HSPC）大量诱导为iNKT细胞。3.分离纯化小鼠脾脏iNKT细胞进行大量的扩增。1.将成熟的iNKT细胞核转移至胚胎干细胞（ES），大量克隆iNKT细胞，此方法技术难度较大，胚胎干细胞获取困难，克隆效率低；2.骨髓来源的成体造血干细胞（HSPC）大量诱导为iNKT细胞，研究表明通过此方法将小鼠HSPC大量诱导为iNKT细胞非常困难，这对于临床前的基础研究具有极大的限制性。3.小鼠脾脏来源的iNKT细胞的纯化扩增，操作较为繁琐、耗时长且脾脏iNKT细胞已为成熟的iNKT，分化能力较差，无法定向诱导其分化方向。以上三种方法共同的缺点为：成本高、过程复杂、周期长、获得iNKT细胞的量少且难于定向获取具有特定功能的iNKT细胞，这对于肿瘤、感染及许多自身免疫性疾病的iNKT细胞过继输注的细胞免疫治疗及相关研究产生了巨大的限制性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法，以解决现有方法过程复杂、周期长、获得iNKT细胞的量少且难于定向获取具有特定功能的iNKT细胞的问题。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法，该方法包括两个阶段：第一阶段为体内刺激iNKT细胞增殖，使用特异性的刺激剂α-Galcer刺激小鼠体内iNKT细胞增殖；第二阶段为体外定向诱导iNKT细胞扩增，取经α-Galcer刺激的小鼠胸腺，制备单细胞悬液，并加入α-Galcer、诱导剂以辅助iNKT细胞扩增并引导其分化。所述两个阶段主要包括以下步骤：a、于6周龄DBA/1雄性小鼠尾根部皮下单次注射刺激剂α-Galcer；b、8天后，将小鼠脱颈处死，取胸腺制备单细胞悬液，并进行细胞计数；c、用含有α-Galcer、诱导剂的培养基将细胞密度调整为2×106个/ml，并置于37℃、5vol%的CO2培养箱中培养；每4~5天为细胞换液及传代，第14天收获细胞。步骤a中，所述α-Galcer的用量为2μg/只。步骤c中，所述α-Galcer的浓度为100ng/ml。步骤c中，所述诱导剂为IL-2、IL-4和维生素C，其中，IL-2的浓度为100IU/ml，IL-4的浓度为25IU/ml，维生素C的浓度为1μmol/ml。步骤c中，所述培养基为KBM-551加入青霉素、链霉素和15vol%FBS。步骤c中，所述KBM-551培养基中加入β-巯基乙醇，β-巯基乙醇的终浓度为0.05mmol/ml。本专利技术采用体内刺激增殖与体外诱导扩增相结合的方法定向诱导iNKT细胞，并通过特定的抗原刺激时间、刺激强度、刺激频率以及特定的小鼠周龄、性别、器官（胸腺）、不同的体外刺激培养条件等手段，实现了在短时间内（14天）获得大量（频率高达40.07%，细胞数提高6万倍）定向分化并具有特定功能的iNKT细胞。体内刺激与体外实验的活化相比可以使iNKT细胞更充分被激活，有利于体外细胞培养时，iNKT细胞的扩增，为体外诱导扩增打下基础。体内刺激与体外实验相结合可以有效地减少细胞体外扩增培养时复杂繁琐的步骤，缩短细胞培养的时间，减少体外细胞诱导时所产生的细胞形态功能变异以及污染等许多让人头疼的问题。此外，本专利技术还具有可重复性强、成本相对较低的优点。附图说明图1是iNKT细胞频率及各亚群细胞的检测图。具体实施方式下面通过实施例详细说明本专利技术，本专利技术实施例中所用的试剂：α-半乳糖神经鞘胺醇（α-Galcer）为ENZOLifeSciences公司产品；FITCHamsterAnti-MouseTCRβChain（553170）、PerCP-CyTM5.5Mouseanti-T-bet（561316）、AlexaFluor®647MouseAnti-PLZF（563490）购自BD公司；PE-T-selected-CD1dtetramer购自日本MBLInternational,Woburn，MA公司；Foxp3/TranscriptionFactorStainingBuffer购自eBiosdence；KBM551培养基购自康宁公司；胎牛血清，购自Gibco公司；青霉素、链霉素购自Invitrogen公司；2-疏基乙醇购自Amresco公司；HumanIL-2购自MihenyiBiotec公司；MurineIL-4购自Peprotech公司；维生素C（VC），购自Sigama公司。实施例1：iNKT细胞定向诱导扩增（1）于6周龄DBA/1雄性小鼠尾根部皮下单次注射刺激剂α-Galcer（2μg/只）；（2）8天后，将小鼠眼球取血后脱颈处死；（3）将小鼠完全浸在75%的酒精中1min，然后将小鼠四肢固定在解剖盘取胸腺；（4）将胸腺置于含PBS的培养皿中，并用PBS清洗2~3次，去除血污；（5）之后将胸腺置于200目筛网（筛网置于含有PBS的培养皿），用眼科剪把胸腺剪成2~3mm大小的块，然后研磨，研磨充分后，用移液枪将组织液移入10ml离心管，1000r/min离心5min，弃去液体，然后用PBS清洗两次（1000r/min，5min），（整个过程在冰上操作）；所得细胞经FACS检测iNKT频率可达7.95%，经MACS磁珠分离iNKT纯度达70%~80本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法，其特征是，该方法包括两个阶段：第一阶段为体内刺激iNKT细胞增殖，使用特异性的刺激剂α‑Galcer刺激小鼠体内iNKT细胞增殖；第二阶段为体外定向诱导 iNKT细胞扩增，取经α‑Galcer刺激的小鼠胸腺，制备单细胞悬液，并加入α‑Galcer、诱导剂以辅助iNKT细胞扩增并引导其分化。

【技术特征摘要】
1.一种胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法，其特征是，该方法包括两个阶段：第一阶段为体内刺激iNKT细胞增殖，使用特异性的刺激剂α-Galcer刺激小鼠体内iNKT细胞增殖；第二阶段为体外定向诱导iNKT细胞扩增，取经α-Galcer刺激的小鼠胸腺，制备单细胞悬液，并加入α-Galcer、诱导剂以辅助iNKT细胞扩增并引导其分化。2.根据权利要求1所述的胸腺来源的iNKT细胞定向诱导扩增的方法，其特征是，所述两个阶段包括以下步骤：a、于6周龄DBA/1雄性小鼠尾根部皮下单次注射刺激剂α-Galcer；b、8天后，将小鼠脱颈处死，取胸腺制备单细胞悬液，并进行细胞计数；c、用含有α-Galcer、诱导剂的培养基将细胞密度调整为2×106个/ml，并置于37℃、5vol%的CO2培养箱中培养；每4~5天为细胞换液及传代，第14天收获细胞。3.根据权利要求2所述的胸腺来源的i...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟明，王园园，刘慧芳，陈冬志，张金库，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北,13