水稻黄单胞hrf1基因用于转基因植物育种的方法技术

一种水稻黄单胞ｈｒｆ１基因重组载体是通过以下方法构建而成： （１）ｈｒｆ１基因序列：如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示 （２）以ｈｒｆ１基因作为目的基因构建在植物表达的Ｔｉ－质粒双元载体ｐＢⅠ１２１上：用于构建双元转化－表达载体的质粒的是由Ｔ－ＤＮＡ改造而来，其中除Ｔ－ＤＮＡ２５ｂｐ重复序列（ＬＢ和ＲＢ），胭脂碱合成酶基因的启动子Ｐ－ｎｏｓ和终止子Ｔ－ｎｏｓ外，还有在原核生物（细菌）中作为选择标记使用的ｎｐｔⅠ和在真核生物（植物）中作为选择标记使用的ｎｐｔⅡ，用于选择的抗生素均为Ｋｍ和Ｇ－４１８；另外在ｐＢＩ１２１中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子３５Ｓ（ｐ３５Ｓ）和β－葡糖醛酸酶（Ｇｕｓ）基因ｕｉｄＡ；作为目的基因使用的ｈｒｆ１基因插入在ｐＢⅠ１２１质粒的ｐ３５Ｓ和ｕｉｄ之间的多酶切克隆位点上，所用内切酶为ＸｂａＩ和ＢａｍＨＩ，即获得基因重组载体。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术“”属于生物
，专用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。(二)技术背景1.基因hrf存在于水稻黄单胞(Xanthomonas oryzae)两个致病变种(pv.oryzae和pv.oryzicola)和其他黄单胞细菌(Xanthomonas spp.)中，属于过敏反应和致病性(hypersensitive response andpathogenicity，hrp)基因簇成员。大多数革兰氏阴性植物病原细菌都有hrp基因簇，其中编码诱导植物产生过敏反应的蛋白质(Harpin)的基因各不相同。目前已对革兰氏阴性4个属植物病原细菌中的hrp基因簇进行了全序列测定，并依据基因簇的结构，操纵子的组成和调节基因的共线性关系等特征将已知的4种类型hrp基因簇分为两组。第I组包括梨火疫欧文氏菌(E.amylovora)和丁香假单胞(Pseudomonas syringae pv.syringae)；第II组包括青枯拉尔氏菌(Ralstonia solanacearum)和甘兰黑腐黄单胞(Xanthomonas campestris pv.campestris)。关于编码harpins的基因，在梨火疫病菌中是hrpN，在丁香假单胞中是hrpZ，在青枯拉尔氏菌中是pop1，在水稻白叶枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)中是hrf1。不同植物病原细菌来源的编码Harpins基因的序列比较发现，获得hrf1基因的代表菌株为水稻黄单胞白叶枯致病变种的JXOIII，这一菌株为公知公用菌株(陈功友等.2001，水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzae)化学诱变hrp基因突变体及相关性状的研究，植物病理学报.31(3)199～207)。作为hrp基因簇成员hrf1对致病性有调节作用，但体外表达的蛋白质产物具有诱导抗病性、抗虫性和促进植物生长等有益效应。Hrf1基因编码的蛋白质HarpinXo具有Harpin蛋白家族的特征蛋白质亲水性，对热稳定，等电点为酸性4.3左右。与报道的Harpins蛋白家族成员HarpinEa和HarpinPss不同之处在于HaprinXo含有一个半胱氨酸，氨基酸残基中有GGG-GG重复单元，3～5μg/ml可诱导植物产生细胞编程死亡(PCD)。本课题组的前一个专利技术“一种编码植物生长调节剂的基因表达产物及其用途”(专利申请号00135403.5；公开号CV 1300547A)已对从水稻黄单胞白叶枯致病变种(X.oryzae pv.oryzae)中获得的hrf1基因及其表达产物HarpinXoo在体外直接应用即以制剂形式进行浸种、拌种、蘸根和叶面喷雾以及用hrf1基因构建重组微生物的应用进行了专利保护。以hrf1基因的表达产物HarpinXoo作为制剂在植物体外直接喷雾后，可以激活植物防卫反应相关酶，如苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(PO)和多酚氧化酶(PPO)的活性，同时诱导病程相关蛋白基因如PR-1b和PR-1a基因的表达。其中PR-1b基因受茉莉酸分子的调控，PR-1a受水杨酸分子的调控(Eyal et al.，1993，Ohshima et al.，1990)。其中茉莉酸和水杨酸作为信号分子在诱导植物抗虫、抗病性中起作用。另外，在番茄上使用时，还能启动pto介导的信号反应，其中pti4/5/6和效应基因PR-1a1、PR-1b1、NP24、Pin2在不同时间有不同程度的增强表达。作为与hrpN同类，但其蛋白质产物明显不同的水稻黄单胞编码HarpinXo的基因hrpA可能在植物基因工程中作为目的基因有应用价值。植物基因工程是以具有明确功能的外源基因作为目的基因，通过一定的技术路线转化植物后，随机整合到植物基因组中，使其在植物体内表达，来改善植物的抗病、抗虫和其他有益性状。如苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫蛋白(ICP)可以作为生物制剂喷洒植物进行害虫防治，基因转化棉花后，转基因棉花对棉铃虫也有抗性(A 01N63/02 CN 95113498.1A)；抗菌肽(Cecropin)基因转化烟草、马铃薯和水稻后，转基因植物表现对这些植物上的细菌病害有抗性(贾士荣，1993)。通过转基因技术还可以改善作物品质如耐贮性、耐盐性、氨基酸品质和植物脂质等。作为Harpin基因家族的一个成员，来自梨火疫病菌(Erwinia amylovora)的编码HarpinEa的基因hrpN已在美国研发生物农药Messenger中成功应用，作为目的基因用于转基因马铃薯和苹果，分别对马铃薯晚疫病(Phytophthora infestans)和梨火疫病(Erwinia amylovora)的抗病性有不同程度的改善。但是hrf1基因还没有在植物转基因育种工程技术中的得到应用。目前也没有有关以hrf基因为目的基因的hrf基因转基因育种方法的报道。技术方案本专利技术所提供的一种水稻黄单胞hrf1基因重组载体是通过以下方法构建而成1)hrf1基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示2)hrf1基因作为目的基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBI121上用于构建双元转化—表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA 25bp重复序列(LB和RB)，胭脂碱合成酶基因的启动子(P-nos)和终止子(T-nos)外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptI和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素均为Km和G-418；另外在pBI121中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA；作为目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121质粒的p35S和uid之间的多酶切克隆位点上，所用内切酶为XbaI和BamHI，即为重组载体。本专利技术所提供的水稻黄单胞hrf1基因重组载体的转基因植物育种方法为3)构建的双元转化重组载体质粒pBI121∷hrf1，可以直接转化于含vir区辅助质粒不带Km抗性的pTiBo542衍生质粒的感受态根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中；也可以用含pBI121∷hrf1的大肠杆菌DH5α，在帮助质粒pRK2013存在情况下，通过三亲交配转移到EHA105中。EHA105是EHA101(C58/pTiBo542)的Km敏感衍生株。4)同时含有辅助质粒pTiBo542(Kms)和转化质粒(pBI121∷hrf1)的根癌土壤杆菌EHA105用于植物细胞的转化，重组根癌土壤杆菌转化植物细胞的方法用叶碟法、胚转化法或花粉管导入方法。5)外植体在含Km的植物再生培养基中筛选被转化的再生植株(T0代)T1代种子催芽时用Km(150μg/ml)浸泡12小时进行筛选转化植株，对T1代植株按株系检测转化频率以及植株中hrf1基因的表达。6)转化株系的检测方法用PCR和Southern印迹杂交法检测转化植株叶片中hrf1基因和P-35S启动子，hrf1基因的表达用定量RT-PCR方法检测植株叶片中hrf1基因的RNA的积累。根癌土壤杆菌EHA105为公知公用菌株，基因重组转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种水稻黄单胞hrf1基因重组载体是通过以下方法构建而成(1)hrf1基因序列如序列表SEQ ID NO.1所示(2)以hrf1基因作为目的基因构建在植物表达的Ti-质粒双元载体pBI121上用于构建双元转化—表达载体的质粒的是由T-DNA改造而来，其中除T-DNA 25bp重复序列(LB和RB)，胭脂碱合成酶基因的启动子P-nos和终止子T-nos外，还有在原核生物(细菌)中作为选择标记使用的nptI和在真核生物(植物)中作为选择标记使用的nptII，用于选择的抗生素均为Km和G-418；另外在pBI121中还有在真核生物表达的花椰菜花叶病毒的启动子35S(p35S)和β-葡糖醛酸酶(Gus)基因uidA；作为目的基因使用的hrf1基因插入在pBI121质粒的p35S和uid之间的多酶切克隆位点上，所用内切酶为XbaI和BamHI，即获得基因重组载体。2.根据权利要求1所述的水稻黄单胞hrf1基因重组载体，其特征在于，Ti-质粒双元载体指的是Ti-质粒双元载体pBI121。3.根据权利要求1或2所述的水稻黄单胞hrf1基因重组载体，其转基因植物育种的方法为将构建的双元转化重组载体质粒pBI121...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金生，邵敏，董汉松，陈功友，高学文，李平，杨春，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：