一种2－萘酸降解菌DNA片段的核苷酸序列及其制备方法和应用技术

一种２－萘酸降解菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　　ｓｐ．ＪＴ１５００）的ＤＮＡ片段，该ＤＮＡ片段的核苷酸序列为ＳＥＱ　　ＩＤ　　Ｎｏ：１。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种2-萘酸降解菌DNA片段的核苷酸序列，涉及含有该DNA片段的重组质粒和重组菌株的制备方法。具体地说，本专利技术涉及2-萘酸降解菌(Burkholderiasp.JT1500)的一段具有降解2-萘酸活性的DNA片段，该DNA片段含有两个关键基因2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，涉及含有该DNA片段的重组质粒和表达相应酶的重组菌株。
技术介绍
偶氮芳香族化合物在自然界中广泛存在，而且每年以数百万吨的数量被制造出来。尤其是印染工业中偶氮染料的广泛使用产生大量的印染废水，对环境构成严重的污染和危害。微生物降解芳香族环境污染物具有投资少、占地小又不需要特殊设备等优点，逐渐成为最有前途的治理环境污染物的方法。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质的化合物，通过研究2-萘酸的微生物代谢途径，确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因，可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。在微生物降解芳香族环境污染物的研究中，关于2-萘酸代谢研究的报道很少，仅有1997年Birgit Morawski等报道过2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)降解2-萘酸的代谢途径，其具体的基因和基因调控机理并未有报道。2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因未曾有过报道，他们在2-萘酸降解过程中所起的作用更未曾有报道。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一段2-萘酸降解菌的具有降解2-萘酸活性的DNA片段的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的是提供含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株。本专利技术的再一个目的是提供一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组菌株的制备方法，并将其用于高效降解2-萘酸及其它偶氮类芳香族化合物。本专利技术提供了一种2-萘酸降解菌的具有降解活性的DNA片段，其核苷酸序列如SEQNo1所示。按照本专利技术的DNA片段，含有两个关键基因2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因序列。其中2-萘酸单加氧酶基因序列为SEQ ID NO1中所示编号为第2793-3951位的核苷酸序列，共1158bp。该基因编码的单加氧酶的氨基酸序列为SEQ ID No2。辅酶A(CoA)连接酶的基因序列为SEQ ID No1所示编号为第4042-5793位的核苷酸序列，共1751bp。该基因编码的辅酶A(CoA)连接酶的氨基酸序列为SEQID No3。本专利技术还提供了含有如上所述DNA序列的重组表达质粒。本专利技术还涉及含有上述的重组表达质粒的重组菌株，如大肠杆菌HB101重组菌株。本专利技术还提供了一种制备含有所述DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株的方法，包括以下步骤从2-萘酸降解菌Burkholderia sp.JT1500菌株中提取总DNA，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，将其连接到pUC18载体上并转化大肠杆菌HB101，获得含2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A(CoA)连接酶基因，总长8050bp的DNA片段的重组表达质粒和重组大肠杆菌菌株。附图说明图1为含有本专利技术所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的重组质粒构建模式图。图2为本专利技术所述的2-萘酸降解菌的DNA片段的核苷酸序列。图3为本专利技术的2-萘酸单加氧酶基因所编码的氨基酸序列。图4为本专利技术的辅酶A(CoA)连接酶基因所编码的氨基酸序列。下面结合附图对本专利技术进行详细描述。本专利技术首先从2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)菌株提取总DNA，然后用限制性内切酶EcoR I部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到各酶切片段。将酶切片段与经过EcoR I酶解的pUC18质粒DNA，加入TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系，16℃反应30min后，连接产物转化大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于LB固体培养基上，经过培养，转化子平板上长出了若干蓝色菌落，得到能使大肠杆菌转化子细胞积累靛蓝的重组菌株。挑取其中一个单菌落培养，用碱裂解法提取质粒，用限制性内切酶水解重组质粒，根据电泳结果证实已插入了一段8kb的2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)的DNA片段。该DNA片段经测序，其核苷酸序列如图2所示(SEQ ID No1)。对该序列作进一步研究，通过与国际已有基因库进行序列比对，发现在编号2793-3951处有一1158bp，编码386个氨基酸的序列与基因库中一些单加氧酶基因有较高同源性与已报道的Ralstonia eutropha HF39羟化酶基因(单加氧酶基因)(bec)3’末端的780bpDNA序列有86％的同源性，与bec的氨基酸序列有64％的同源性。另有一段1751bp(在编号第4042-5793位)的核苷酸序列所编码的氨基酸序列与Amycolatopsis sp.HR167辅酶A连接酶有42％的同源性，与其他辅酶A连接酶也有一定相似性。进一步利用靓蓝生成、酶活分析等试验进一步确认该8050bp的DNA片段上含有2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因。在2-萘酸降解过程中，单加氧酶基因起羟化底物(2-萘酸)作用，而辅酶A连接酶基因则使底物连上辅酶A，为进一步的降解创造条件。因此本专利技术提供了一种可能性，即通过分子生物学手段，将本专利技术涉及的2-萘酸单加氧酶基因和辅酶A连接酶基因克隆到大肠杆菌或其它受体菌上，为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。下面通过实施例对本专利技术作进一步详细的说明，下述实施例仅用于说明而不是限制本专利技术。实施例12-萘酸降解菌总DNA的提取过程将2-萘酸降解菌(Burkholderia sp.JT1500)接种于5ml LB培养基，30℃，140rpm摇床培养过夜，6000g离心10min，收集菌体。加入2.7ml DNA抽提缓冲液，充分悬浮；加入20μl 20mg/ml蛋白酶K，37℃水浴摇床200rpm摇30min后加入0.3ml 20％SDS，轻轻颠倒几次混匀，置恒温水浴箱静置，65℃温浴2h，期间每隔15-20min上下颠倒几次混匀，直至澄清，6000rpm室温离心10min，上清液转至新的离心管中。加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1 v/v)抽提两次，将上清转至新的离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温静置1h或更长一点；14000rpm室温离心20min收集粗DNA。DNA用70％的乙醇轻轻溜洗，弃上清后置干净工作台上晾干，最后加入适量含RNA酶的无菌水溶解，转至1.5ml离心管，即得到该菌DNA。实施例2克隆过程和测序取前面所述的总DNA溶液10μl，用限制性内切酶EcoR I部分水解，经琼脂糖凝胶电泳，得到各酶切片段。取6μl(5μg)酶解DNA片段与3μl(2μg)经EcoRI酶解的pUC18质粒DNA，加入9ml TaKaRa DNA Ligation Kit Ver2.0 solution I构建连接反应体系，16℃反应30min；连接产物转化已用氯化钙法制备的大肠杆菌HB101感受态细胞。将转化子涂布于含75μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基上。经过培养，转化本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙国萍，李小波，郭俊，方向平，许玫英，任随周，曾国驱，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：