制备共轭脂肪酸的方法技术

本发明专利技术涉及通过乳酸菌产生的特异性异构酶，生物异构化制备共轭脂肪酸，该酶将９ｃ，１２ｃ不饱和脂肪酸异构化形成９ｃ，１１ｔ共轭脂肪酸，如９ｃ，１１ｔ共轭亚油酸，９ｃ，１１ｔ共轭亚麻酸，本发明专利技术也涉及对该乳酸菌进行诱变、修饰、异构酶基因克隆等手段来制备共轭脂肪酸，以及以上述方法制备的共轭脂肪酸的各类产品和与共轭脂肪酸相关的乳酸菌产品。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，具体的说，描述了通过乳酸菌产生的特异性异构酶，生物异构化制备共轭脂肪酸，具体的说是9c，11t共轭亚油酸，9c，11t共轭亚麻酸。
技术介绍
共轭脂肪酸是指含有一对共轭双键的脂肪酸，由于其具有特定的生理活性，已引起人们的高度重视，如共轭亚油酸和共轭亚麻酸等，目前研究较多的是共轭亚油酸。共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是一组位置(C8，C10；C9，C11；C10，C12；C11，C13)和几何(cis，cis；cis，trans；trans，cis；trans，trans)异构体的十八碳共轭二烯酸的统称。在自然界，CLA主要存在于反刍动物的肉和乳的脂肪中，每克脂肪含0.83-5.5mg，其异构体主要是9c，11t-CLA。大量的研究表明CLA有抗癌、减肥、抗动脉粥样硬化、抗II型糖尿病等作用。CLA的制备方法有两种，一种是化学异构法，另一种是生物异构法。化学异构法需要在强碱和高温下进行，其产物是含有8，10-CLA、9，11-CLA、10，12-CLA和11，13-CLA多种异构体的复杂混合物，含有许多非天然并且安全性未知的异构体，尽管有人试图用尿素包合法和脂酶酯化法来富集一些异构体，但其选择性差，几乎不可能把这些异构体一一分开，而且很不经济。生物异构法在酶的作用下进行，反应条件温和。Kepler首先发现瘤胃中的溶纤丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)能将亚油酸异构化成9c，11t-CLA，但是由于瘤胃菌是严格厌氧菌，菌体培养要求严格，并且CLA会被还原成饱和脂肪酸，因此制约了瘤胃菌用于生产CLA。后来，人们从发酵乳制品(如酸奶、奶酪等)中分离到能生产CLA的丙酸菌和乳酸菌。Jiang对常用乳制品发酵剂进行研究，发现费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)能将游离亚油酸转化成CLA，其中9c，11t/9t，11c-CLA大于70％。Lin从6种乳酸菌中筛选到一株产9c，11t-CLA量较高的嗜酸产气乳杆菌(Lactobacillus acidophilusCCRC14079)，Pariza从饲喂亚油酸的老鼠肠道菌群中筛选到一株路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri ATCC23272)能将亚油酸异构化成9c，11t-CLA，不生成10t，12c/10c，12t c-CLA。Kishino发现植物乳杆菌(Lactobacillus plantarumAKU1009a)异构化生成的CLA，其异构体由9c，11t-CLA(或9t，11c-CLA)和9t，11t-CLA组成。因此，从易于培养的乳酸菌中筛选到能异构化形成单一CLA异构体，特别是9c，11t-CLA，将使大规模制备具有特定生物活性的CLA异构体成为可能，并将应用于药品、食品等方面。此外，大多数乳酸菌是一种人体益生菌，筛选到具有异构化酶活性的乳酸菌将进一步拓宽乳酸菌的应用范围。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过乳酸菌产生的特异性异构酶，生物异构化制备共轭脂肪酸，该酶将含有9c，12c不饱和脂肪酸异构化形成9c，11t共轭脂肪酸，如9c，11t共轭亚油酸，9c，11t共轭亚麻酸，本专利技术也涉及对乳酸菌进行诱变、异构酶基因克隆等手段来制备共轭脂肪酸。本专利技术的目的也是提供新的产品，通过本方法制备单一共轭脂肪酸异构体的各类产品和与共轭脂肪酸相关的乳酸菌产品。本专利技术的技术方案为一种，利用乳酸菌产生的特异性异构酶，通过生物异构化将脂肪酸制备成共轭脂肪酸。该特异性异构酶将9c，12c不饱和脂肪酸异构化形成9c，11t共轭脂肪酸。该共轭脂肪酸可以是9c、11t共轭亚油酸或9c、11t共轭亚麻酸。异构化的原料可以是脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪酸甘油酯。该乳酸菌是嗜酸乳杆菌，编号为CMCC1.1854。利用该乳酸菌异构化的菌体、酶提取物来制备共轭脂肪酸。该乳酸菌可经过诱变、遗传改造、提高制备共轭脂肪酸的生产水平。该乳酸菌的异构酶基因可以被克隆来制备共轭脂肪酸。以共轭脂肪酸和其衍生物制备的药品、保健品和食品。以该乳酸菌生产的与共轭脂肪酸相关的产品。本专利技术的优点在于本方法可以得到单一共轭脂肪酸异构体，比其它方法的异构体更纯。可以作为很好的生产原料。具有异构化酶活性的乳酸菌将进一步拓宽乳酸菌的应用范围。附图说明图1为本专利技术所制备共轭亚油酸的紫外扫描示意图；图2为本专利技术所制备共轭亚麻酸的紫外扫描示意图；图3为亚油酸浓度对CLA的影响；图4为培养时间对CLA的影响。具体实施例方式本专利技术基于9c，11t-CLA是存在于食品中的主要CLA异构体，且生理功能明确，因此筛选能产生特异性异构酶的乳酸菌，生物异构化制备共轭脂肪酸，从而实现单一共轭脂肪酸异构体的大量制备和应用。筛选能异构化亚油酸形成CLA的方法在上述文献中均有报道，通过这种方法从乳酸菌中筛选到能异构化亚油酸形成共轭亚油酸(图1)，该菌还能将亚麻酸异构化形成共轭亚麻酸(图2)。利用毛细管电泳对异构化形成的共轭亚油酸进行分析，发现异构化形成的共轭亚油酸由单一9c，11t-CLA组成，由于目前还没有共轭亚麻酸异构体的标品，因此未能确定异构化形成的共轭亚麻酸是何种异构体，根据亚油酸和亚麻酸均具有9c，12c双键的结构和酶作用的专一性，因此推断共轭亚麻酸的异构体是9c，11t共轭亚麻酸。选择合适的发酵条件，可以进一步提高9c，11t-CLA的产量，亚油酸的浓度、作用时间、温度、pH、O2浓度等条件均与其产量有关。研究发现该乳酸菌中的异构酶是胞内酶，该乳酸菌菌体和酶提取物也能异构化脂肪酸形成共轭脂肪酸，为提高菌体和酶的利用率，增加经济效益，还可通过现有的固定化技术来固定化细胞或固定化酶来生产共轭脂肪酸。本专利技术筛选到的乳酸菌不仅可以异构化游离脂肪酸，还可异构化脂肪酸盐(如钠盐、钙盐等)、脂肪酸酯(如甲酯、乙酯等)、脂肪酸甘油酯(如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)，但游离脂肪酸和脂肪酸盐的转化率较高，因此可根据原料和生产工艺选用合适的生产共轭脂肪酸的方法。对乳酸菌进行紫外诱变，分离到一株异构化水平提高的突变株，当然，还可通过化学诱变，甚至对其中的脂肪酸异构酶基因进行克隆来构建工程菌株，这对于本领域的技术人员而言是很容易做到的事。异构化生成的共轭脂肪酸可通过现有的技术进行分离，并可达到制药要求的高纯度产品。获得的单一共轭脂肪酸异构体可以根据其用途制成游离脂肪酸(9c，11t共轭亚油酸、9c，11t共轭亚麻酸)、脂肪酸盐(如钠盐、钙盐等)、脂肪酸酯(如甲酯、乙酯等)、甘油酯(如甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)，其可以是固体或液体。单一共轭脂肪酸异构体和其衍生物可以作为药品、食品使用。乳酸菌是一种人体益生菌，本专利技术所用的乳酸菌由于具有异构化脂肪酸的活性，进一步拓宽乳酸菌的应用范围。因此，本专利技术也包括利用该乳酸菌生产的与共轭脂肪酸相关的药品、食品。在本文件中，术语药品泛指所有从本专利技术产品衍生的有治疗保健作用的产品，并且既包括以本专利技术产品为主要成分制成的产品也包括以其作为组成成分或添加剂制成的产品。例如药品可以是抗癌药、减肥药、心血管疾病药、抗II型糖尿病药、抗菌药、抗病毒药、美容、护肤等。在本文本中，术语食本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备共轭脂肪酸的方法，其特征在于：利用乳酸菌产生的特异性异构酶，通过生物异构化将脂肪酸制备成共轭脂肪酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹郁生，刘晓华，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：36[中国|江西]