使用属于嗜甲基菌属的细菌产生芳香族L-氨基酸的方法技术

本发明专利技术提供了使用属于嗜甲基菌属的细菌生产芳香族Ｌ－氨基酸的方法，其中所述细菌被修饰以增强涉及芳香族Ｌ－氨基酸流出的基因，特别是来自大肠杆菌的ｙｄｄＧ、ｙｄｄＬ、ｙｄｄＫ和ｙｄｄＪ基因的表达。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物工业，并具体涉及使用属于嗜甲基菌属(Methylophilus)的细菌产生芳香族L-氨基酸、特别是L-苯丙氨酸的方法，其中所述细菌已被修饰以增强编码涉及芳香族L-氨基酸流出(efflux)的蛋白质的基因的表达。
技术介绍
使用属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、青霉属(Penicillium)、假丝酵母属(Candida)等等的微生物通过发酵，来工业化生产L-氨基酸，例如L-赖氨酸、L-谷氨酸、L-苏氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。为了改善生产率，已使用了从天然分离的菌株或其人工突变体。已经公开了各种技术以通过使用重组DNA技术通过增强L-谷氨酸生物合成酶的活性来增加L-谷氨酸生产能力。 通过培育例如以上提到的那些微生物和改进生产方法，已经显著地增加了L-氨基酸的产生。然而，为了满足未来增加的需求，开发以更低成本生产L-氨基酸的更为有效的方法仍是所期望的。 为了通过甲醇的发酵生产氨基酸(甲醇是可以以低成本大量获得的原料)，通常已知的方法包括使用属于无色杆菌属(Achromobacter)或假单胞菌属(Pseudomonas)(日本专利公告(Kokoku)No.45-25273/1970)、精朊杆菌属(Protaminobacter)(日本专利申请公开(Kokai)号49-125590/1974)、精朊杆菌属(Protaminobacter)或甲烷单胞菌属(Methanomonas)(日本专利申请公开(Kokai)号50-25790/1975)、微环菌属(Microcyclus)(日本专利申请公开(Kokai)号52-18886/1977)、嗜甲基菌属(Methylobacillus)(日本专利申请公开(Kokai)号4-91793/1992)、芽孢杆菌属(Bacillus)(日本专利申请公开(Kokai)号3-505284/1991)等等的微生物。 已经公开了通过培养属于嗜甲基菌属的细菌来生产L-苯丙氨酸的方法，所述细菌具有产生L-苯丙氨酸的能力并对苯丙氨酸类似物，例如DL-对-氟苯丙氨酸、间-氟苯丙氨酸和苯丙烯酸(cinnamic acid)有抗性(EP1134283B1)。 并且，已经公开了通过在培养基中培养具有生产L-氨基酸的能力的微生物，从而L-氨基酸积累在培养基中，并从培养基收集L-氨基酸，来生产L-氨基酸，包括L-苯丙氨酸的方法，其中所述微生物是具有Entner-Doudoroff途径的甲醇利用细菌，在所述途径中6-磷酸葡糖酸脱水酶活性和/或2-酮基-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸醛缩酶活性增强(美国专利申请20040142435A1)。 还公开了通过在含有甲醇作为主要碳源的液体培养基中培养已被修饰从而使ybjE基因的表达增强的微生物，来生产L-氨基酸，包括L-苯丙氨酸的方法(PCT申请WO05073390A2)。 已经公开了通过在培养基中培养埃希氏菌属(Escherichia)细菌来生产L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸或L-色氨酸的方法，所述细菌的L-氨基酸生产率已经通过提高仅由yddG基因编码的蛋白质的活性来提高(PCT申请WO03044192A1)。 但是目前，还没有为了使用属于嗜甲基菌属的甲醇利用细菌生产L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸，而增强yddG、yddL、yddK和yddJ基因表达的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的包括增强芳香族L-氨基酸生产菌株的生产能力以及提供使用这些菌株生产芳香族L-氨基酸的方法。 通过发现在属于嗜甲基菌属的细菌中、特别是食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)中增强来自大肠杆菌(E.coli)的yddG、yddL、yddK和yddJ基因的表达，可以提高芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，优选L-苯丙氨酸的生产而实现了上述目的。 本专利技术提供了具有提高的生产芳香族L-氨基酸，例如L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸，优选L-苯丙氨酸的能力的属于嗜甲基菌属的细菌。 本专利技术的目的是提供属于嗜甲基菌属的具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌，其中所述细菌已经被修饰以增强编码涉及芳香族L-氨基酸流出的蛋白质的基因的表达。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述基因是从属于埃希氏菌属的细菌获得的。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述基因包括yddG、yddL、yddK和yddJ。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述表达通过修饰控制所述基因表达的表达控制序列来增强。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述表达通过增加所述基因的拷贝数来增强。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的细菌，其中所述细菌是食甲基嗜甲基菌。 本专利技术的进一步的目的是提供生产芳香族L-氨基酸的方法，其包括-在含有甲醇作为主要碳源的培养基中培养如上所述的细菌来产生和分泌所述芳香族L-氨基酸到培养基中，和-从培养基中收集所述L-氨基酸。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。 本专利技术的进一步的目的是提供如上所述的方法，其中所述芳香族L-氨基酸是L-苯丙氨酸。 以下详细描述本专利技术。附图说明附图1显示了PCR扩增的DNA片段的结构，所述片段带有RBSfmd和编码用于全套苯丙氨酸流出泵(efflux pump)的来自大肠杆菌的yddG、yddL、yddK、yddJ基因。 附图2显示了带有yddG基因的缺失衍生物的结构。 优选的实施方式1.本专利技术的细菌本专利技术的细菌是属于嗜甲基菌属、具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌，其中所述细菌已经被修饰以增强涉及芳香族L-氨基酸流出的基因的表达。 在本专利技术中，“具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌”是指一种细菌，当在培养基中培养该细菌时它具有产生和分泌L-氨基酸到培养基中的能力。在此使用的术语“具有生产芳香族L-氨基酸的能力的细菌”还指一种细菌，其相比于食甲基嗜甲基菌(M.methylotrophus)的野生型或亲本菌株，例如食甲基嗜甲基菌AS1，能够以更大的量产生L-氨基酸并引起L-氨基酸在培养基中积累，优选的是指该微生物能够以不低于0.05g/L、更优选不低于0.1g/L目标L-氨基酸的量在培养基中引起积累。术语“芳香族L-氨基酸”包括L-苯丙氨酸、L-色氨酸和L-酪氨酸。L-苯丙氨酸是特别优选的。 嗜甲基菌属包括以下细菌Methylophilus freyburgensis、Methylophilusleisingeri、食甲基嗜甲基菌本文档来自技高网...

【技术保护点】
属于嗜甲基菌属的细菌，其具有生产芳香族Ｌ－氨基酸的能力，其中所述细菌已经被修饰以增强编码一种或多种蛋白质的基因的表达，所述蛋白质与芳香族Ｌ－氨基酸流出有关。

【技术特征摘要】
RU 2005-12-27 20051406491.属于嗜甲基菌属的细菌，其具有生产芳香族L-氨基酸的能力，其中所述细菌已经被修饰以增强编码一种或多种蛋白质的基因的表达，所述蛋白质与芳香族L-氨基酸流出有关。2.根据权利要求1的细菌，其中所述基因是从埃希氏菌属细菌获得的。3.根据权利要求2的细菌，其中所述基因包括yddG、yddL、yddK和yddJ。4.根据权利要求1的细菌，其中所述表达通过修饰控制所述基因表达的表达控制序列来增强。5.根据权利要求1的细菌，其中所述表达通过增加所述基因的拷贝数来增强。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：伊里那L托克马科瓦，纳塔尔亚V戈尔什科瓦，埃琳娜G阿巴拉基纳，尤尔吉斯AV约曼塔斯，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]