一种低保真DNA聚合酶及应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域。公开了一种低保真Ｔａｑ　　ＤＮＡ聚合酶突变体，其保真度比野生型低１８倍，且具有能使ＡＴ转换为ＧＣ的特性。本发明专利技术提供了获得该低保真ＤＮＡ聚合酶突变体的方法；含有该低保真ＤＮＡ聚合酶突变体基因的重组质粒以及利用该ＤＮＡ聚合酶突变体建立的能使碱基ＡＴ转换为ＧＣ的诱变方法。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及体外基因诱变方法领域，与体外基因定向改良方法有关。
技术介绍
TaqDNA聚合酶是从水生栖热菌(Thermus aquaticusYTl)中分离纯化的一种DNA聚合酶， 该酶具有很好的热稳定性，在72 — 74。C具有最高活性，是PCR (Polymerase Chain Reaction)) 反应的关键酶，被广泛用于医疗诊断，法医鉴定和生命科学研究等领域。然而，TaqDNA聚合酶不 具有3' —5'的校正活性，在PCR过程中，有大约万分之一的碱基会发生碱基替换导致分子诱变， 因此，Ste匿r利用这一性质建立了 DNA改组(英文名称为DNA shuffling, Ste隨r, W. P. Ripid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling ， Nature, 1994 370:389-391)，己经广 泛用于体外定向分子进化。但是，野生型Taq DNA聚合酶其诱变效率是很低的，尽管有人用Mn+ +取代Mg++可降低Taq DNA聚合酶的保真度，但是，由于\&!++是Taq DNA聚合酶的抑制剂，常 常会影响PCR的正常扩增。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术不能定向选择AT碱基定向诱变的技术难题，利用互补兼 并引物诱变方法对Taq DM聚合酶进行诱变，以获得一个能选择性地将碱基AT转换为GC的 低保真DNA聚合酶，该酶可通过PCR程序应用于DNA分子的体外诱变和髙AT含量基因的体外 改良。本专利技术筛选获得一个低保真DNA聚合酶,并发现该酶具有选择AT碱基转换为GC的特性， 这一特性不仅可用于DNA分子的体外诱变而且对于富含AT基因的定向改良以及富集GC含量将 是非常有用的。本专利技术通过以下方案实施申请人获得一种低保真TaqDNA聚合酶，它具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，其 661位为缬氨酸，666位为异亮氨酸(如图l和序列表SEQ ID NO: 1所示)。同时申请人获得了一种能够编码上述低保真Taq DNA聚合酶的DNA序列，它具有如SEQID NO: l所示的核苷酸序列。进而，申请人制备了一种重组的DNA载体，该载体含有SEQ ID NO; 1所述的核苷酸序 歹U。该重组DNA载体是pQE60-Taq，其保藏号为CCTCC NO: M206052。用于制备上述重组载体的特异引物，它如下列序列构成 正向引物5 ， -ATGVKVVKKKVKKVVYYKYVVYWVYYVWWVKKKKWVVWVWYVGGC;反向弓！物5, -GCCKWYKYKKYVVVVKYY画KYW訓VWWKKVVKVVVKKVKCAT 。 一种低保真Taq DNA聚合酶的制备方法，包括下列步骤1) 用重组DNA载体pQE60-Taq (保藏号为CCTCC NO: M206052)转化大肠杆菌；2) 利用高压细胞破碎仪破碎大肠杆菌的细胞，收集细胞抽提液；3) 利用绿色荧光蛋白的发光特性鉴别T叫DNA聚合酶保真度的高低，和4) 通过DNA测序进一步验证低保真度TaqDNA聚合酶对DNA碱基突变的选择性，得到所 述的低保真Taq DNA聚合酶。详细技术方案如下所示 1、 pQE60-Taq重组质粒的构建以含有Taq dna聚合酶的质粒pLSGl (参见Lawyer,等，Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquatiCUS The Journal of Biology Chemistry 1989 264:6427-6437)为模板，进行PCR 扩增。其引物如下正向引物为5 ， —ATACCATGGGGGGGATGCTGCCCCTCTT反向引物为5' -ACTAGATCTTGGGGCCTCGAGGACCAG 反应体系(50ul): IX PCR缓冲液Tris-Hcl pH7.8, 1. 5mM Kcl, 1. 5mM Mgcl 10mM ATP, lOmM GTP, lOmM TTP， lOraM CTP, 10pM引物，2. 5单位DNA聚合酶(购自New England Biolabs公司)。PCR条件94。C预热3分钟，94°C 40秒，50°C 72°C 3分钟，25个循环。酶解PCR产物用限制性内切酶酶解，酶解反应(50ul)含有5ul IOX酶解缓冲液(购自 Qiagen公司)，20y 1 PCR产物，1-2u 1限制性内切酶(购自Qiagen公司)，加水至终体积为 50u l.在37'C下保温2-5小时。酶解产物纯化按Qiagen公司PCR纯化试剂盒及操作程序进行.具体过程是取150ulPB 缓冲液(购自Qiagen公司)与50 u 1酶解产物混合，上纯化柱(购自Qiagen公司)，以14000 转/分钟离心1分钟,弃去流出液，再加750ul PE缓冲液(购自Qiagen公司)，用同上步骤 离心洗一次，最后，加50y l.无离子水，同上离心收集纯化酶解DNA。连接连接反应(20ul)含有2ul IX连接缓冲(购自Qiagen公司)，2-4ul预先酶解好 的载体pQE60(购自Qiagen公司)，2-4 y 1酶解PCR产物'1 y 1 T4DNA连接酶(购自Qiagen 公司)，加水至终体积20u1.放4'C保温过夜。转化将连接混合物与100W大肠杆菌感受态细胞DH5 a (购自New England Biolabs公司) 混合，冰浴放置30分钟，42°C处理90秒，加800ul LB培养基(见Molecular Cloning, A laboratory manual, 1982， p68) , 37。C保温1小时.铺含氨苄青霉素lOOPg/ml LB平皿，37'C保温12小时，获得含有pQE60-Taq重组质粒的转化子。pQE60-Taq重组质粒制备将含有pQE60-Taq重组质粒的转化子接到3ml含有氨节青霉 素(100ixl/ml) LB培养基(W胰蛋白胨，O. 5%Nacl, 1%酵母粉pH7. 5见Molecular Cloning, A laboratory manual, 1982， p68)，在37。C培养过夜，按Qiagen公司质粒制备试剂盒和操 作程序抽提质粒。方法如下以6000转/分钟离心培养物，收集菌体；加250ml缓冲液A (购自Qiagen公司)悬浮菌体；加250ml缓冲液B (购自Qiagen公司)混匀；再加300ul缓 冲液C (购自Qiagen公司)，混匀。以14000转/分钟离心5分钟。收集上清液上柱，加750 yl PE缓冲液(购自Qiagen公司)，同上离心，弃去流出液，最后，用80ul无离子水洗脱 质粒DNA。2. 、建立随机突变文库以pQE60-T叫为模板进行PCR扩增，其步骤如下 互补兼并引物设计根据与Taq DNA聚合酶序列设计互补兼并引物正向引物为5' -ATGVKVVKKKVKKVVYYKYVVYWVYYVWWVKKKKWVVWVWYVGGC 反向引物为5 ， -GCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低保真ＴａｑＤＮＡ聚合酶，其特征在于，它具有ＳＥＱＩＤＮＯ：１所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1、一种低保真Taq DNA聚合酶，其特征在于，它具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。2、 根据权利要求l所述的低保真TaqDNA聚合酶，其特征在于，所述的氨基酸序列的661 位为缬氨酸，666位为异亮氨酸。3、 编码权利要求1或2的低保真TaqDNA聚合酶的DNA序列，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:l所示。4、 一种重组的DNA载体，其特征在于含有权利要求3所述的核苷酸序列。5、 权利要求4所述的重组DNA载体，该载体是pQE60-Taq,其保藏号为CCTCC NO: M206052。6、 根据权利要求3或4所述的DNA序列,其特征在于，其引物如下列组成 正向引物5 ， -ATGVKVVKKKVKKVVYYKYVVYWVYYVWWVKKKKWVVWVWYVGGC;反向引物5' -GCCKWYKYKKYVVVVKYYKW...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘子铎，洪玉枝，张炼辉，喻子牛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]