根癌农杆菌介导zeocin抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法技术

根癌农杆菌介导ｚｅｏｃｉｎ抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母，将外源基因整合到宿主染色体上，属于基因工程中转化技术领域。本发明专利技术通过构建质粒ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ，将其电击转化根癌农杆菌。通过将含有目的质粒ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ的根癌农杆菌和产甘油假丝酵母共培养，利用ｚｅｏｃｉｎ抗性基因为筛选标记，实现了ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ对产甘油假丝酵母的转化。根据根癌农杆菌的生长特性，对转化条件进行了优化，在共培养时间为２４ｈ，细胞比例为１∶５００－１０００时最高转化率达到２个转化子／１０↑［４］个酵母细胞。初步建立了根癌农杆菌介导转化工业化产甘油假丝酵母的转化方法，为进一步研究产甘油假丝酵母打下基础。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
根癌农杆菌介导ｚｅｏｃｉｎ抗性基因转化工业化产甘油假丝酵母的方法，其特征是以质粒ｐＰＩＣＺＢ为模板通过ＰＣＲ技术获得ｚｅｏｃｉｎ抗性基因，再与线性化质粒ｐＣＡＭ３３００连接，获得重组质粒ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ；质粒ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ转化根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，再和产甘油假丝酵母共培养，根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ质粒转化工业化产甘油假丝酵母；（１）ｚｅｏｃｉｎ基因的克隆根据ｚｅｏｃｉｎ基因的特异性设计引物：引物Ｒ：５’－ＧＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＧＣＣＡＣＧＡＡＧ－３’；引物Ｆ：５’－ＡＴＧＧＣＣＡＡＧＴＴＧＡＣＣＡＧＴＧＣＣＧＴＴＣ－３’；ＰＣＲ扩增ｚｅｏｃｉｎ基因得到３００ｂｐ的特异条带；ＰＣＲ方法如下：取质粒ｐＰＩＣＺＢ模板１μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液２μＬ，引物Ｒ、Ｆ各１μＬ，ｄＮＴＰｓ２μＬ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶０．５μＬ，总反应体积为２０μＬ；循环参数：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５６℃９０ｓ，７２℃９０ｓ，３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ；通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用ＰＣＲ片断胶回收试剂盒纯化出０．３ｋｂ的目标片断，纯化好的目标片断与ｐＥＧＭ－Ｔ－Ｅａｓｙｖｅｃｔｏｒ连接保存；再用相应ＥｃｏＲⅠ酶切，胶回收ｚｅｏｃｉｎ目标基因，ＥｃｏＲⅠ酶切线性化质粒ｐＣＡＭ３３００；在Ｔ４连接酶的作用下连接得到ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ；（２）质粒ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ转化根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４将重组质粒ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ通过电击直接转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，在卡那霉素抗性平板上挑取抗性转化子，提取质粒酶切验证，得到重组菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ；（３）根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ质粒转化工业化产甘油假丝酵母：将重组菌ＬＢＡ４４０４／ｐＣＡＭ３３００－ｚｅｏｃｉｎ于ＬＢ培养基中，３０℃，２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养３６ｈ，离心收集菌体；用等体积的ＩＭ培养基重悬，培养６ｈ；接种产甘油假丝酵母ＷＬ２００２－５于ＹＰＤ培养基中，３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ摇床培养过夜；产甘油假丝酵母的ＹＰＤ培养液按１∶５稀释到ＹＰＤ新鲜培养基中，培养６ｈ；分别离心收集根癌农杆菌菌体和产甘油假丝酵母，用生理盐水清洗一次，用ＩＭ培养基重悬菌体，产甘油假丝酵母细胞终浓度达到１０...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，徐美娟，张君胜，沈微，方慧英，诸葛健，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]