本发明专利技术涉及一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素Ｈ产量的方法，包括如下步骤：（１）将镰刀菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＡＴＣＣ １１７１１菌株置于种子培养基中，在２０～３５℃，１００－２５０ｒ／ｍｉｎ条件下培养１８～３０ｈ；（２）将镰刀菌ＡＴＣＣ １１７１１种子液以４－１０％接种量转接至发酵培养基，并于０～４８ｈ内加入２．５～２０ｍｇ.Ｌ↑［－１］酪氨酸，除菌后，在２０～３５℃，１００－２５０ｒ／ｍｉｎ条件下培养３～５ｄ；（３）过滤或离心得到的菌丝体置于烘箱中烘至恒重，再经丙酮浸泡抽提或超声波处理离心收集抽提液；（４）利用高效液相色谱和薄层层析分析得到抽提液中冬青生菌素Ｈ的浓度。该方法操作简单、产量稳定、可为工业化生产冬青生菌素Ｈ提供新的思路和途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属抗生素生产领域，特别是涉及一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌 素H产量的方法。技术背景至今共有8种冬青生菌素(代号分别为A H)被人们所发现，它们的来源、分子式 和分子结构以及性质见下表1。 1971年，日本学者Hayakawa首次在山毛榉树枯萎叶片中 分离出来的柱枝双孢菌属冬青生菌(Q///"^oc/ai//ww ///c/co/a) MFC-870中发现冬青生菌 素H。冬青生菌素H (ilicicolinH)的分子式为C27H31N04，为浅黄色片状晶体，dragendorff 试剂测试阴性，具有抗真菌活性，它的作用机制在最近才被阐明在酵母中可作用于线粒 体，抑制电子在呼吸链泛醌位点中的传递。研究冬青生菌素H毒性时，发现在50^g，mL—1 浓度下，它对大鼠肝细胞线粒体没有显著活性(不出现肿胀、变形)，对大鼠肝细胞的IQo 约为lrr^mL—1。据此推测它可能是一种对人类低毒，对部分真菌高毒的化合物，具有潜在 的开发应用前景。_表l 冬青生菌素家族(Ilicicolins)_<table>table see original document page 4</column></row><table><formula>formula see original document page 5</formula>目前以镰刀菌生产冬青生菌素H存在产量低的问题，通过利用优化后的镰刀菌发酵培养基，产量仅比未优化前提高2 3倍；而利用优化后的镰刀菌发酵培养条件(例如摇床转速、培养温度、初始pH等)时，产量也提高不多。因此针对产量低的问题，应考虑次 级代谢产物生物合成中产物的合成前体是调控代谢向次级代谢产物积累的方向进行、并且 增加其产量的一个重要因素。由于镰刀菌代谢冬青生菌素H的代谢途径尚未有文献报道，不能全面了解冬青生菌素 H在镰刀菌中的生物合成途径，故而不清楚对冬青生菌素起积极作用的因素，例如有关酶Park SRI International生物组织化学实验室的Tanabe和Urano通过 利用放射性元素13C标记醋酸盐、14C和15N标记苯丙氨酸研究冬青生菌素H的生物合成 途径，发现冬青生菌素H是经过一系列碳架重排合成，证实其前体是醋酸盐和苯丙氨酸。 随后，1998年英国的学者Moore等在利用球孢白僵菌研究布氏白僵菌素生物合成途径时发 现酪氨酸同样是冬青生菌素H的前体。因此，向发酵培养基中添加苯丙氨酸、酪氨酸以及 乙酸盐，都可能会促进冬青生菌素H在另一真菌——镰刀菌内的生物合成。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H 产量的方法，该方法操作简单、转化率高、产量稳定、环保，可为工业化大规模生产冬青 生菌素H提供新的思路和途径。本专利技术的一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素H产量的方法，包括如下步骤(1) 镰刀菌F^an'wmo;c^pon/mATCC 11711菌株(购自美国菌种保藏中心)的种子 培养将1 2片1 cm直径的镰刀菌琼脂培养物置于成分包括2 10 g七.1葡萄糖，0.2 2.5 g-L—'蛋白胨，0.2 1.5 g七"酵母浸膏，0.5 3 g七"NaCl的种子培养基中，在20 35。C， 100—250 r/min条件下培养20 30 h;(2) 镰刀菌Fwrahwm 0;9;577www ATCC 11711菌株的发酵培养以4— 10%接种量将 镰刀菌种子液转接至成分包括5 15g丄"葡萄糖/蔗糖，0.5 3g丄"蛋白胨，0.2 1.5g-I/1 酵母浸膏，1 3g'L"NaCl的发酵培养基，并于0 48h内将2.5 20mg丄"酪氨酸添加入 培养基，100 130。C时灭菌10 40min后，在20 35。C， 100—250 r/min条件下培养3 5 d;(3) 发酵培养结束后通过过滤或离心得到菌丝体，以2 4倍于菌丝体体积的丙酮浸 泡菌丝体浸泡抽提过夜，或经超声波处理10 35min后再高速离心收集抽提液；为了获得 菌丝体干重，可将菌丝体置于烘箱中烘至恒重后称重；(4) 利用高效液相色谱和薄层层析分析得到抽提液中冬青生菌素H的浓度。步骤(1)所述的种子培养基成分包括5g七"葡萄糖，lg七"蛋白胨，0.5g丄"酵母浸 膏，lg.L"NaCl。步骤(1)所述的发酵培养基成分包括10g七"葡萄糖/蔗糖，2g丄"蛋白胨，lg七"酵 母浸膏，2g七"NaCl。步骤(2)优选酪氨酸前体的添加量为12.5 mg七—1。步骤(2)优选酪氨酸前体的添加时间为发酵Oh，即配制发酵培养基时直接加入。 步骤(3)利用G3坩埚进行过滤操作，在9000—18000 r/min条件下离心10 30min。 步骤(4)所述的薄层层析是在HSGF254型的预制硅胶板上点样，展开剂为乙酸乙脂和石油醚的混合物，v/v=2:3，用254nm波长的紫外灯观察。步骤(4)所述的高效液相色谱分析在规格为150mmX4.60mm， 5 pm的配备色谱柱Phenomenex LunaC18或C8柱的液相色谱仪上进行，流动相为乙腈-水缓冲液，v/v=30:70，检测波长为254 nm,流速为1.0 mL/min。所述的培养镰刀菌生产冬青生菌素H的过程是间歇式或分批补料式。有益效果(1) 本方法操作简单、稳定、可控性强，利用镰刀菌发酵生产抗生素一冬青生菌素H，安 全环保；(2) 利用前体物质酪氨酸可以有效提高镰刀菌合成冬青生菌素H的产量，为工业化生产 提供新的思路和途径。附图说明图1为酪氨酸浓度对冬青生菌素H产量的影响；. 图2为酪氨酸适宜添加时间的选择；图3为添加酪氨酸后镰刀菌合成冬青生菌素H与对照组的历程比较。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术 而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术 人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。实施例11. 镰刀菌Fw^n'w附o;c少5poram ATCC 11711菌株的种子培养镰刀菌ATCC 11711菌株种子培养基5g七"葡萄糖，lg七"蛋白胨，0.5g七"酵母浸 膏，1 g'U1 NaCl, pH自然；以镰刀菌ATCC 11711菌株为生产菌种，在28。C， 120 r/min 条件下培养24 h。2. 镰刀菌ATCC 11711菌株的发酵培养镰刀菌ATCC 11711菌株发酵培养基10g'L—'葡萄糖，2g'L"蛋白胨，1 g丄"酵母浸膏，2 g'L/1 NaCl， 一定浓度的酪氨酸，pH自然；以5%接种量，在28。C， 120 r/min条件 下培养4d。发酵结束后利用G3坩埚过滤或离心(9000—18000 r/min)得到菌丝体，并置 于烘箱中烘至恒重测得菌丝体干重；利用2倍于菌丝体体积的丙酮浸泡抽提菌丝体过夜或 以超声波处理15min后再高速离心收集抽提液；利用高效液相色谱分析得到的抽提液中冬 青生菌素H的浓度。实验中以未加酪氨酸的发酵培养为对照。3. 酪氨酸的添加方式在配制镰刀菌的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用添加酪氨酸提高镰刀菌合成冬青生菌素Ｈ产量的方法，包括： （１）镰刀菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＡＴＣＣ １１７１１菌株的种子培养：将镰刀菌１～２片１ｃｍ直径的琼脂培养物置于成分包括２～１０ｇ.Ｌ↑［－１］葡萄糖，０．２～２．５ｇ.Ｌ↑［－１］蛋白胨，０．２～１．５ｇ.Ｌ↑［－１］酵母浸膏，０．５～３ｇ.Ｌ↑［－１］ＮａＣｌ的液体种子培养基中，在２０～３５℃，１００－２５０ｒ／ｍｉｎ条件下培养１８～３０ｈ； （２）镰刀菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ＡＴＣＣ １１７１１菌株的发酵培养：以４－１０％接种量将镰刀菌种子液转接至成分包括５～１５ｇ.Ｌ↑［－１］葡萄糖／蔗糖，０．５～３ｇ.Ｌ↑［－１］蛋白胨，０．２～１．５ｇ.Ｌ↑［－１］酵母浸膏，１～３ｇ.Ｌ↑［－１］ＮａＣｌ的发酵培养基，并于０～４８ｈ内将２．５～２０ｍｇ.Ｌ↑［－１］酪氨酸添加入培养基，１００～１３０℃时灭菌１０～４０ｍｉｎ后，在２０～３５℃，１００－２５０ｒ／ｍｉｎ条件下培养３～５ｄ； （３）发酵培养结束后通过过滤或离心得到菌丝体，以２～４倍于菌丝体体积的丙酮浸泡菌丝体浸泡抽提过夜，或经超声波处理１０～３５ｍｉｎ后再高速离心收集抽提液；如需得到菌丝干重，则将菌丝体置于烘箱中烘至恒重后称重； （４）利用高效液相色谱和薄层层析分析得到抽提液中冬青生菌素Ｈ的浓度。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：洪枫，邓晨，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。