本发明专利技术涉及一种以重组枯草杆菌表达系统表达天蚕素ＣＡＤ抗菌肽的方法，通过人工合成ｓｕｍｏ蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素ＡＤ的融合蛋白表达操纵子基因，克隆天蚕素ＡＤ母体基因枯草杆菌表达载体ｐＮＦ１１，转化重组表达载体ｐＮＦ １１－ＣＡＤ，从而使重组枯草杆菌在摇瓶中诱导表达；本发明专利技术具有表达系统简单，用于大规模生产，生产成本低，生物活性强，无毒害物质等优点；为临床上的疾病防治和治疗提供一种价格便宜、抗菌力强的药物，也可作为饲料添加剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生产抗菌肽CAD的方法，具体讲涉及一种以重组枯草杆菌 表达系统表达抗菌肽CAD的方法。
技术介绍
昆虫抗菌肽是一类碱性小分子多肽，具有热稳定性、诱导源的非专一性和 广谱的杀菌作用，极有希望开发成一类新型的多肽抗生素。己知当某些致病菌 侵染天蚕( 0/0/7/20ra cecra; z'a )后，可在其血淋巴中诱导产生溶菌酶、Attacin及 天蚕素(Cecropin)等三大类包括大约15—20种具有杀菌活性的蛋白质(Hultmark D.etal,Eur. J. Biochem. 106: 7-16,1980)。基于一级结构的小的差异，天蚕素被 分为A、 B和D三种类型(HultmarkD.etal， 1980，文献同上)。另外，也已从中 国柞蚕中分离到一系列类似的抗菌肽。这些来自不同昆虫的对植物病原菌有杀 伤作用的肽在本文中统称为抗菌肽，它们之间的氨基酸序列有较高的相似性， 分子富含亲水性氨基酸残基，特别是富含赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸；而C 端则包含较多的疏水性残基。另外，发现在这类肽的许多特定位置上带有保守 的氨基酸残基，如2位上的色氨酸；5、 8和9位上的赖氨酸，以及11和20位 上的天冬氨酸等(SteinerH.et al， Nature 292: 246-248, 1981)。由于抗菌肽在杀菌、抗肿瘤甚至抑制病毒复制方面具有较大的应用潜力， 因此国内外在抗菌肽的基因工程方面开展了不少研究工作，有关抗菌肽基因在 大肠埃希氏菌、酵母、以及昆虫杆状病毒载体中的表达研究均已有报道。在"天蚕抗菌肽AD基因在AcNPV载体系统中的表达研究"(黄亚东，中 国抗生素杂志，28:304-307, 2003)—文中报道了一种利用昆虫杆状病毒载体系统 在昆虫培养细胞和虫体中表达多肽抗生素天蚕抗菌肽AD (cecropin AD, CAD)的 方法。其实验采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)点突变技术改造 CAD基因，改造后的CAD基因先克隆到质粒pGEM-T easy vector中进行鉴定和序列分析，然后亚克隆到苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒AcNPV表达载体 pAcGP67B中获得重组病毒载体。用重组病毒载体和野生AcNPV DNA共感染 草地夜蛾Sf9细胞，筛选得到重组病毒。以重组病毒转染Sf9细胞和苜蓿丫纹 夜蛾幼虫，抑菌活性试验CAD基因在昆虫杆状病毒载体系统获得了表达，表达 产物具有抑菌活性。在"抗菌肽AD基因的改造及在毕赤酵母中的表达"(黄亚东，华南理工大 学学报自然科学版，30:13-16， 2003)—文中报道了一种采用PCR技术改造抗菌 肽AD基因，将其C末端改造为Asn编码，改造后的抗菌肽CecropinAD基 因克隆到pPICZ-A载体上，构建成酵母重组分泌型表达载体，转化毕赤酵母 Pichiapastoris受体菌GS115中。采用zerocin抗性标记筛选重组转化子，经摇 瓶发酵，浓縮发酵液进行酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析和抑菌活性检测。结果 表明，改造后的Cecropin AD基因在毕赤酵母中获得了表达，表达产物经信号 肽引导分泌到胞外，具有较强的杀菌活性。专利ZL96100376.6公开了四种具有抗菌活性的多肽或其功能的衍生物及其 生产抗菌肽的方法，其中培养细胞为大肠杆菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆 虫细胞和哺乳动物细胞。以上文献和专利公开的生产抗菌肽的方法，采用了在病毒、大肠杆菌细胞、 酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达目的基因。而使用病毒 载体系统表达目的蛋白质，实验步骤繁琐，条件不易于控制，不适合大规模生 产；由于抗菌肽会对大肠杆菌等细菌具有抑制作用，因此难以使用原核生物中 的大肠杆菌作为表达系统；抗菌肽虽然对真核细胞没有抑制作用，但研究表明 抗菌肽在酵母中表达很难实现酵母的高密度培养，对提高表达量有较大影响， 此外，抗菌肽在酵母中表达酰胺化不完全，对其杀菌活性有一定影响，同时真 核细胞表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点。
技术实现思路
7本专利技术的目的在于提供一种广谱抗菌的抗菌肽CAD的基因工程生产方法， 以克服当前抗菌肽产业化的诸多问题，为临床上的疾病防治和治疗提供一种价 格便宜、抗菌力强的药物，也可用作无危害的饲料添加剂。而目前还没有用枯 草杆菌表达抗菌肽CAD的报道。枯草杆菌是一种原核细胞，具有培养条件易于 控制，繁殖速度快，分泌量高的特点。本专利技术采用的技术方案为 1. sumo蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白和天蚕素AD的融合 蛋白表达操纵子基因合成a)人工合成含编码sumo蛋白酶的表达操众子基因，其核苷酸序列为:1020304050atggtcagcatccgccgceigcttcgaagcgtatgtcgatgacatgaatat60708090100cattactgttctgattcctgctgaacaaasggaaatcatgcttgttccgg110120130140150aacttaatgaaaaagatgatgatcaagttctgcatctaga160170180190200gaaaatacacaacttatgaatagagataatattgaaattacagttagaga210220230240250ttttaaaacacttgc3ccgagaagatggcttaatgatacaattattgaat260270280290300tttttatgaaatatattgaa犯atctac3ccgaatacagttgcatttaat310320330340350tcttttttttatacaaatctttctgaaagaggctatcaaggcgttagaag3603703803904 00atggatgaaaagaaaaaaaacacEiaattgEitaaacttgataaaattttta410420430440450caccgattaatcttaatcaatctcattgggcacttggcattattgatctt460470480柳500aaaaaaaaaacaattggctatgttgattctctttctaatggcccgaatgc510520530540550aatgtcttttgcaattcttaC3gatcttcaaaaatatgttatggaagaat560570580590600ctaaacatacaattggcgaagattttgatcttattcatcttgattgcccg610620630640650caacaaccgaatggctatgattgcggcatttatgtttgcatgaatacact660670680690700ttatggctctgcagatgcaccgcttgattttgattataaagatgcaatta710720730740747gaatgagaag atttattgca catcttattcttacagatgc acttaaab)人工合成含编码酿酒酵母小分子泛素样蛋白与天蚕素AD的融合蛋白表达操 纵子基因，其核苷酸序列为1020304050taaaaaaaacgctcacatga鹏ggcgtttttttta本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种生产抗菌肽ＣＡＤ的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤： １）ｓｕｍｏ蛋白酶的表达操纵子、酿酒酵母小分子泛素样蛋白和天蚕素ＡＤ的融合蛋白表达操纵子的基因合成； ２）天蚕素ＡＤ母体基因枯草杆菌表达载体ｐＮＦ１１的构建； ３）重组表达载体ｐＮＦ１１在枯草杆菌１Ａ７４７中的转化；和 ４）重组枯草杆菌在摇瓶中的诱导表达。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：祝发明，谯仕彦，姬生跃，宋青龙，明耀华，潘宝海，张建东，岳隆耀，王春平，
申请(专利权)人：北京龙科方舟生物工程技术中心，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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