一种灵芝杂交育种方法技术

一种灵芝杂交育种方法，包括亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选。由于灵芝孢子的细胞壁很厚，在人工条件下几乎不萌发，难以进行杂交育种，本发明专利技术通过菌丝裂解形成单细胞，并萌发成单核菌株进行杂交育种，整个过程不超过２０天即可完成，单核细胞的获得率不低于３５％，具有杂交育种的速度快、成功率高、后代遗传性状稳定等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种食用菌育种方法，特别是一种灵芝杂交 育种方法。
技术介绍
食用菌的育种方法一般包括野生种驯化、诱变育种、原 生质体融合育种、基因工程育种和杂交育种等。野生种驯化是从野生灵芝子实体中分离获得菌丝体，经过栽培试验， 筛选获得优良菌种，这种育种方法需要分离获得大量的菌株，从中选出高 产优质的品种，只能从现有的菌株中筛选，不能创造出新的种性。诱变育种是通过物理或化学的手段，促进变异，再从众多的变异体 中筛选出好的品种，这是一种随机性很强育种方法，需要大量的筛选才有 可能获得好品种。原生质体融合育种是一种用于远缘杂交克服"种间性隔离"的技术， 上世纪八十年代在食用菌广泛研究，但由于在有丝分裂过程中有些染色体 会丢失，融合子不稳定，这种育种技术未得到广泛应用。基因工程育种是近年来发展起来的新技术，具有目标明确的特点， 但这一技术在食用菌育种中还处在研究试验阶段，尚未广泛应用。杂交育种，国外有用酵母菌与灵芝孢子共培养，培养时间4一6周， 可诱导少量灵芝孢子萌发，萌发率低于1/108。国外的这种方法存在以下 缺点①试验时间长；②萌发率很低，需要大量的试验才能获得可用于 杂交的单孢菌株；◎需要除去酵母菌后才能用于杂交。由于酵母菌的生 长速度远远快于灵芝菌丝，如果没有除去酵母菌，经常会由于酵母菌大量 生长而使灵芝菌丝不生长。杂交育种是一种有效的品种改良技术，杂交育种可以组合双亲的优 良性状、表现出杂种优势，培育出超越亲本的杂交种。杂交育种在食用菌 中已广泛应用，取得很大成效。现代医学研究证明，灵芝对治疗神经衰弱、慢性支气管炎、冠心病、 心绞痛及高血脂、高血压、肝炎、造血系统疾病等有良好的疗效。由于含有灵芝多糖，灵芝可以提高机体免疫功能，增强体质，具有抗肿瘤的作用。我国灵芝年产量约2000吨，创产值约20亿元人民币，在50多种食用 菌中单种产值最大。但由于我国灵芝人工育种研究相对落后，我国主栽的 品种都是从国外引进或者是从引进品种分离获得。这种状况在一定程度上 制约灵芝产业的发展。鉴于灵芝具有很高的药用价值，灵芝产业又是一个很大的产业，如 果能建立一种高效的杂交育种技术，将会促进灵芝新品种的培育，进而促 进灵芝产业的进一步发展
技术实现思路
本专利技术目的是探索解决灵芝杂交育种中单孢菌株难以 获得的问题，为灵芝的杂交育种提供一种新方法。本专利技术的，包括灵芝亲本菌株选择、菌丝培养、 再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交， 杂交菌株培养并筛选，其特征在于1、 所述菌丝裂解将经过2次活化、处于生长对数期中期的亲本液体菌丝分别放入离心 管中，离心后取沉淀，并加入无菌水清除菌丝外壁的杂质，再用稳渗液清 洗，将清洗后的菌丝悬浮于溶壁酶液，于3(TC的循环水浴锅中恒温水浴 至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；所述稳渗液为0.6M甘露醇水溶液； 所述溶壁酶液为含2%溶壁酶的稳渗液。2、 所述单细胞再生，离心单细胞裂解液，取沉淀，并用再生培养基清洗沉淀至单细胞外不 含溶壁酶，然后用再生培养基稀释至单细胞浓度为2 3个/低倍镜视野， 将单细胞稀释液涂布至再生培养基平板中，并倒置培养皿于25'C培养箱 中培养，至单细胞开始萌发；3、 所述单核细胞分离从单细胞萌发的培养皿中挑取单个已长出芽管的单细胞连同培养基 放入斜面培养基中，于25。C培养，长出3 5cm的菌落时，镜检挑取无锁状联合的菌株，即为单核菌株。本专利技术的灵芝杂交育种方法，解决了由于灵芝孢子的细胞壁很厚，在人工条件下几乎不萌发，难以进行杂交育种的难题。本专利技术的灵芝杂交育种方法，通过菌丝裂解形成单细胞，并萌发成单核菌株进行杂交育种，整个过程不超过20天即可完成，单核细胞的获得 率不低于35%，杂交育种的速度快、成功率高。利用本专利技术的方法进行灵芝杂交育种，其后代的遗传性状稳定，而 无论是诱变育种还是原生质体融合育种所得到的后代，通常遗传性状不稳 定。由于常规的杂交育种需要担孢子作为原材料，而担孢子是从灵芝子 实体中弹射而来，因此常规的杂交育种受季节限制， 一年只能做一批；本 专利技术的杂交育种方法，所用的原材料是灵芝的菌丝，通过液体发酵，几天 时间就可以得到，不受季节限制， 一个月就可以做几批次。具体实施例为了充分公开本专利技术的灵芝杂交育种方法，以下结合 实施例加以说明。实施例 ，包括以下步骤1. 亲本菌株选择选取丰产性状良好的广东赤芝和灵芝5.75为杂交 亲本，转接到PDA斜面中进行活化两次；广东赤芝和灵芝5.75由市场购得。2. 再生培养基配制(g L-l):葡萄糖10. 0、麦芽糖5. 0、酵母膏5. 0、 氯化钾44. 73g、固化培养基添加20 g L-l琼脂；3. 菌丝培养把经2次活化好的菌种接种至PDA培养基中，放置摇 床中培养7天，培养温度为25度，转速为100转每分钟；PDA培养基由 市场购得；4. 菌丝裂解(1) 把在PDA培养基中已经长成的菌丝移入7ml的离心管中，每管 5ml，赤芝与灵芝5.75各两管；(2) 将步骤4 (1)移好菌液的离心管放入高速离心机中10000rpm 离心10min;(3) 将步骤4 (2)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入无菌水， 振荡后再次放入高速离心机中以10000rmp离心10min;(4) 将步骤4 (3)离心过的离心管取出，倒出上清液，加入稳渗液 洗漆，振荡后再次放入高速离心机中离心；(5) 将步骤4 (4)离心过的离心管取出，用无菌滤纸过滤去溶液后， 将收集的菌丝在无菌滤纸上吸干水份，称取0.5g菌丝，放入干净的离心(6) 称取100mg溶壁酶加入另一个干净的离心管，加入5ml稳渗液， 制得溶壁酶液；(7) 向步骤4 (5)放入菌丝的离心管中加入2. 5ml溶壁酶液，振荡；(8) 把步骤4 (7)加入溶壁酶液的离心管放入循环水浴器中3(TC水 浴2.5 3.0h，其间5 10分钟振荡一次，至单细胞完全释放，得单细胞 裂解液；具体方法从离心管中取少量溶液，用血小计数板在显微镜下检 查单细胞数量，至确定单细胞完全释放。5. 单细胞再生(1) 将装有单细胞裂解液的离心管放入离心机中，于4。C，1000rmp 离心20min;(2) 将离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各加入2ml稳 渗液洗涤后再放入离心机以4°C， 1000r即离心20min ;(3) 将步骤5 (2)离心过的离心管取出，倒去上清液，取沉淀，各 加入2ml再生培养基，放入离心机，于4°C， 1000rmp离心20min ;(4) 将步骤5 (3)离心过的离心管取出，倒去上清液，加入再生培 养基稀释，稀释后各取一小滴溶液于载玻片上，盖上盖玻片后放上显微镜 观察，使单细胞浓度为2 3个/低倍镜视野(IOX物镜)；(5) 将稀释后的单细胞液涂平板，每皿涂布0.5ml，倒置平板培养 皿于25'C下培养48小时，单细胞开始萌发。6. 单核细胞分离(1) 将平板培养皿放于显微镜下寻找已萌发并长出芽管的单细胞， 且周围其他部分无相同菌丝；(2) 点燃酒精灯，将接种针于酒精灯上烧红，在显微镜下挑取单个已萌发并长出芽管的单细胞连同一小块培养基的，并确保培养基上无其他 单细胞；(3) 在火焰处拔出斜面培养基上的硅胶塞，将挑出的培养基块本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种灵芝杂交育种方法，包括灵芝亲本菌株选择、菌丝培养、再生培养基配制、菌丝裂解、单细胞再生、单核细胞分离、单核体杂交，杂交菌株培养并筛选，其特征在于　（１）所述菌丝裂解，是将经过２次活化、处于生长对数期中期的亲本液体菌丝分别放入离心管中，离心后取沉淀，并加入无菌水清除菌丝外壁的杂质，再用稳渗液清洗，将清洗后的菌丝悬浮于溶壁酶液，于３０℃的循环水浴锅中恒温水浴至单细胞完全释放，得单细胞裂解液；　（２）所述单细胞再生，即离心单细胞裂解液，取沉淀，并用再生培养基清洗沉淀至单细胞外不含溶壁酶，然后用再生培养基稀释至单细胞浓度为２～３个／低倍镜视野，将单细胞稀释液涂布至再生培养基平板中，并倒置培养皿于２５℃培养箱中培养，至单细胞开始萌发；　（３）所述单核细胞分离，是从单细胞萌发的培养皿中挑取单个已长出芽管的单细胞连同培养基放入斜面培养基中，于２５℃培养，长出３～５ｃｍ的菌落时，镜检挑取无锁状联合的菌株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：谢宝贵，林俊华，邓优锦，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]