睾丸特异蛋白基因序列引物和非电泳检测鉴定奶牛胚胎性别的方法技术

本发明专利技术雄开了一种睾丸特异蛋白基因序列引物，该序列引物为：５’－ＣＣＧＣＣＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＴＴＧ－３’５’－ＧＧＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＴ－３’。以及用常规ＰＣＲ方法和非凝胶电泳法来鉴定奶牛早期胚胎性别的方法。本发明专利技术的睾丸特异蛋白基因序列引物和非电泳检测奶牛胚胎性别的方法，提高了反应的灵敏度，缩短了性别鉴定所需的时间，不容易产生污染，而且适合在胚胎移植现场操作，便于在生产实际中推广应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
一直以来，人们就渴望控制家畜的性别，特别是对于有经济价值的家畜，如牛、羊、猪等。对早期胚胎尤其是附植前胚胎进行性别鉴定，再进行移植，在畜牧生产中具有重要的科学研究价值和商业应用价值。鉴定胚胎性别的方法主要有细胞遗传学分析、X染色体关联酶活性的测定、胚胎发育率差异性分析、雄性特异性抗原的探测以及Y染色体特异性DNA探针的应用。虽然使用流式细胞分类仪已成功分离了X、Y精子，并且有商品化的精液出售，但两种限制因素依然存在，即分选的速度(可用性和价格)和受精率。一时还很难像常规精液一样在实际生产中大面积推广。胚胎移植技术的广泛应用为控制家畜性别创造了另一条新途径。如果一个胚胎在移植之前能够确定性别，移植那些理想性别的胚胎，就可以达到性别控制的目的。随着胚胎移植技术的产业化推广，早期胚胎的性别鉴定技术日益发展成熟，对奶牛早期胚胎进行性别鉴定也是奶牛性别控制的有效途径之一。 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction。以下简称PCR)技术的出现，为性别鉴定提供了新的思路。PCR法因其特异性强、灵敏度高、快速、简便、经济等优点，在家畜早期胚胎的性别鉴定中占有越来越重要的位置，其实质就是Y-染色体特异性片段或Y-染色体上的性别决定基因的检测技术。Herr等利用PCR技术，通过扩增牛胚胎的性别决定基因(SRY)鉴定胚胎性别(Herr CM，Theriogenology，1990，33247-248)。我国的曾溢淘等采用两对引物两次扩增牛的雄性单拷贝基因SRY基因鉴定了胚胎性别(曾溢淘，科学通报，1992，37479-480)。但由于SRY基因是单拷贝基因，其灵敏度较低，需扩增2次，而且扩增产物均采用凝胶电泳进行检测，一般的应用单位不具备条件，所需时间也比较长。Bredbacka针对牛Y染色体高度重复序列区btDYZ-1设计出能扩增出数千kb产物的引物，不用凝胶电泳的方法鉴定胚胎性别，但是无组内对照，易出现假阴性，引起误判(Bredbacka P，Theriogenology，1995，44167-176)。陈从英等采用嵌套式引物鉴定牛早期胚胎性别(畜牧兽医学报，2003，34(3)209～212)，但巢式PCR法扩增雄性特异基因并采用电泳的方法检测产物，扩增过程中需2次加入引物，花费的时间较长。奶牛胚胎性别鉴定技术是否成功，取决于其灵敏度和稳定性。由于从胚胎取得的细胞样品细胞数目较少，其灵敏度如何至关重要。由于SRY、ZFY(锌指结构蛋白基因)等为单拷贝基因，国内外多采取相同引物对两次扩增法或套式PCR法。我国已利用牛的SRY基因和ZFY基因等建立了牛胚胎性别鉴定的PCR技术，但在该技术产业化方面的工作还比较薄弱。
技术实现思路
本专利技术的技术任务是提供一种。 本专利技术的技术任务是按以下方式实现的，该序列引物为5’-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3’5’-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3’。 以及所述的睾丸特异蛋白基因序列引物在奶牛胚胎性别鉴定中的应用。 非电泳检测奶牛胚胎性别的方法，该方法如下步骤先对胚胎分割取样，然后，采用碱处理法提取样品中胚胎细胞DNA模板，将胚胎细胞DNA模板分别放入两个PCR反应管中；之后，其中一管加入睾丸特异蛋白基因序列引物和反应溶液，另一管加入雌雄共有序列引物和反应溶液，在相同PCR反应程序下进行PCR扩增，PCR反应结束后直接将PCR反应管置于紫外灯下激发检测，观察管内荧光，根据荧光的有无或强弱来判断睾丸特异蛋白基因片段是否成功扩增，即该胚胎是公牛还是母牛；如果，两管同时出现荧光，则判断胚胎为公牛；如果只有雌雄共有序列引物反应管出现荧光，则判断为母牛；如果两管均无荧光，则表明胚胎取样失败。 所述的碱处理法的步骤先将分割的胚胎样品转入预先加入5μl碱性裂解液的PCR反应管中，50-70℃，5-15min，其中碱性裂解液包含50mM二硫苏糖醇和200mM的氢氧化钾；然后，再加入5μl中和液，中和液包含900mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH8.3，300mM氯化钾，200mM盐酸；这样便获得了胚胎细胞DNA模板。 所述的反应溶液其中含胚胎样品溶液5μl，10倍的缓冲溶液，1.5mM氯化镁，100mM脱氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0-1μl溴化乙锭，ddH2O。 本专利技术的，提高了反应的灵敏度，缩短了性别鉴定所需的时间，不容易产生污染，而且适合在胚胎移植现场操作，便于在生产实际中推广应用。附图说明附图为非电泳检测鉴定奶牛胚胎性别的方法的流程框图；具体实施方式实施例1在培养皿中放3-4滴(每个液滴200μl)磷酸盐缓冲溶液(PBS)，在体视显微镜(SZX7-3121，OLYMPUS)下用MN-151金属刀片割取胚胎。切割桑椹胚内细胞团的10％左右或囊胚营养外胚层的10％左右样进行活组织检查，切割后的胚胎待移植。每切割一枚胚胎需用70％的酒精和灭菌的超纯水清洗刀片。将6枚胚胎按上述方法分别进行分割取样。 将分割后的6个胚胎样品分别用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3次，用移液枪(规格0.5-10μl)分别吸取分割的胚胎样品(总体积约2μl)，转入0.2mlPCR反应管中(6个)，每个PCR反应管中预先放入5μl碱性裂解液(ALB)(ALB的组成50mM DTT和200mM KOH，即50mM二硫苏糖醇和200mM的氢氧化钾)，65℃，10min。然后加入5μl中和液(900mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸，PH8.3，300mM氯化钾，200mM盐酸)。这样便获得了胚胎细胞的DNA模板溶液约12μl。每份胚胎样品制备的上述溶液又分别加入雄性特异PCR反应管和雌雄共有PCR反应管中，各加入5μl作为PCR反应模板。其中雄性特异PCR反应管含睾丸特异蛋白基因序列引物(5’-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3’和5’-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3’)。雌雄共有PCR反应管含雌雄共有序列引物(5’-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3’和5’-TCGTGAAAACCGCACACTG-3’)。 反应终体积为50μl。其中含胚胎样品溶液5.5μl，10倍的缓冲溶液，1.5mM氯化镁，100mM脱氧核糖核苷酸，1.25U Taq DNA聚合酶，引物各0.1μM，0或1μl溴化乙锭，ddH2O。反应程序为95℃4min；94℃1.5min，Tm 1min，72℃30s.35个循环；4℃保存。PCR反应在PTC-200(MJ Research)上进行。产物采用非凝胶电泳法检测，它是在反应体系中加入溴化乙锭(10μg/ml)后再进行PCR反应，PCR扩增后直接在紫外灯下(302nm)观察管内荧光，采用数码相机记录结果。结果第一行得M为雄性对照，含睾丸特异蛋白基因序列引物的雄性特异PCR反应管1，3，6出现红色荧光；2，4，5无红色荧光。第二行为含雌雄共有序列引物的雌雄共有PCR反应管M为空白对照(无基因组DNA)，1-6均有荧光，则判定1，3，6为雄性奶牛胚胎，2，4，5为雌性奶牛胚胎。本文档来自技高网...

【技术保护点】
睾丸特异蛋白基因序列引物，其特征在于该序列引物为：５’－ＣＣＧＣＣＡＴＴＡＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＴＴＧ－３’５’－ＧＧＧＣＣＧＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＣＡＴ－３’。

【技术特征摘要】
1.睾丸特异蛋白基因序列引物，其特征在于该序列引物为5’-CCGCCATTACGCCCCCGACTTG-3’5’-GGGCCGCTGTTCCTGCTCCTCAT-3’。2.权利要求1所述的睾丸特异蛋白基因序列引物在奶牛胚胎性别鉴定中的应用。3.非电泳检测奶牛胚胎性别的方法，其特征在于该方法如下步骤先对胚胎分割取样，然后，采用碱处理法提取样品中胚胎细胞DNA模板，将胚胎细胞DNA模板分别放入两个PCR反应管中；之后，其中一管加入睾丸特异蛋白基因序列引物和反应溶液，另一管加入雌雄共有序列引物和反应溶液，在相同PCR反应程序下进行PCR扩增，PCR反应结束后直接将PCR反应管置于紫外灯下观察管内荧光，根据荧光的有无或强弱来判断睾丸特异蛋白基因片段是否成功扩增，即该胚胎是公奶牛还是母奶牛；如果，两管同时出现荧光，则判断胚胎为公奶牛；如果...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄金明，刘玉庆，游伟，张俊功，谭秀文，吴乃科，朱荣生，柳尧波，武英，张秀美，
申请(专利权)人：山东省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]