检测新城疫病毒的引物及其应用方法、试剂盒技术

本发明专利技术涉及用于检测新城疫病毒的引物，所述的引物与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在ＤＮＡ聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分。本发明专利技术的用于检测新城疫病毒的引物灵敏度高、特异性强。本发明专利技术还提供一种新城疫病毒的检测方法和一种新城疫病毒的检测试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及禽类感染病毒检测
，特别涉及一种新城疫病毒的检测 试剂盒及检测新城疫病毒的方法。
技术介绍
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV )是可引起禽类的一种以呼吸 道、消化道粘膜出血为典型症状的急性传染病。新城疫病毒属于副粘病毒科、 副粘病毒亚科、腮腺炎病毒属。禽副粘病毒共有9个血清型，即PMV-l至PMV-9， 其中新城疫病毒(NDV)是禽副粘病毒l型(APMV-1)的主要成员。试验表明， 有250多种鸟类可净皮NDV感染，其危害和引发的后果极其严重。1999年农业部发 布的动物疫病目录中将其列为I类疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为A类 疫病。世界动物卫生组织规定对新城疫病毒的检验检疫方法包括病毒的分离鉴 定、琼脂凝胶免疫扩散试验、血凝和血凝抑制试验等。病毒的分离与鉴定首先将样品接种至无特定病原的鸡胚，病毒会随着鸡 胚的发育而增殖，经一星期后抽取鸡胚的尿嚢液，进行血凝和血凝抑制试验， 从而可以判定检测样本中是否含有病毒。该方法的优点是灵敏度高，但是周期 长，约需21天，而且工作量大，需要大量的人力物力。琼脂凝胶免疫扩散试验最早由Oudin于1946年进行对抗原混合物进行分 析。基本原理是在一定孔径的凝胶中，当抗原与抗体分子相遇时，形成抗原抗 体复合物，若两者比例适当，则复合物分子量增大，颗粒增大，不再继续扩散而产生沉淀线。不同的抗原所形成的沉淀有各自的位置，>1人而可以将抗原分开。 该方法的优点是简单易行，不需要特殊仪器，但是由于抗体分子与抗原决定簇的结合并不总是——对应的，而且，由于离子强度、pH等因素，致使该方法的 特异性较低。血凝和血凝抑制试验其基本原理是某些病毒或者病毒的血凝素，能选择 性的使几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝。当病毒 的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时， 则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直"l妄接触。这时红细胞的凝 集现象就被抑制，成为血凝抑制反应。该方法的优点是快速简单，但是由于它 检测的是病毒抗体，而抗体必须在感染后相当一段时间内才能产生，因此，该 方法的应用范围受到限制。随着分子生物学的飞速发展，对新城疫病毒的检测手段也有了快速的发展。 例如采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时逆转录聚合酶链式反应 (real-timeRT-PCR)检测新城疫病毒。这些方法快速简单，灵敏度高，反应时 间较以前的方法短，但仍需要较长时间，而且需要使用PCR仪等贵重仪器，对使 用范围有限制。因此，需要专利技术一种新的新城疫病毒的检测引物及其应用方法以解决上述 问题。
技术实现思路
本专利技术的主要目的之一在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特 异性强的检测新城疫病毒的引物。本专利技术的另一个目的是提供一种灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单的新城疫病毒的检测方法。本专利技术的另一个目的在于基于现有技术的不足而提供一种灵敏度高、特异 性强、反应时间短、操作简单的新城疫病毒的检测试剂盒。本专利技术提供一组用于检测新城疫病毒的引物，所述的引物与新城疫病毒的 核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地 扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术用于检测新城疫病毒的引物，为序列号1~序列号6所示的寡核苷酸，或者序列号1~序列号6所示的寡核苷酸的互补链, 其中R和Y均为简并碱基,R=G+A, Y=C+T。序列号引物名称 序列5'-3'1F3CTGCAGGAATTGTAGTAACAGG2B3ACGTGGACACAGACCCTT3FIPTGGGCATATTCGG及AGCAACTTGCAGTCAATGTi TACACCTCGT4BIPGTGCAAi AGCCCCATTGGAGGAATTCCTTGCGGATi GAGTCGCFLCTATGATTGACCCK3TCTGAG6BLCTACTTTGCTCACTCCTCTTG上述序列号1 6的引物对应SEQ ID NO.l SEQ ID N0.6的引物。本专利技术的检测新城疫病毒引物，灵敏度高、特异性强。6条引物共识别8个 区域，充分保证其特异性。其中F3和B3是外引物，在起始扩增反应时起作用； FIP和BIP称为内引物，在整个扩增过程都起作用，是最关键的一对引物，导致 产生环状的茎环结构而无限扩增；FL和BL称为环状引物，用于提高反应速率。本专利技术提供一种才全测新城疫病毒的方法，该方法用于检测样本中是否存在 新城疫病毒，所述的方法采用的引物可以与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核 苷酸序列的一部分；通过环介导等温扩增法，特异性地扩增新城疫病毒的核苷 酸序列的一部分，确认是否存在有扩增产物。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术检测新城疫病毒的方法，所述的方法包 括如下步骤(1 )准备检测样本； (2)提取样本的总RNA;(3 )对步骤(2 )的RNA进行逆转录反应，得到cDNA;(4) 对步骤(3)的cDNA进行环介导的等温核酸扩增反应，反应温度为 60 ~ 65 °C,反应时间为10 ~ 60分钟；(5) 终止反应；(6) 检测所述扩增引物。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术4全测新城疫病毒的方法，所述的方法的 步骤(3 )和步骤(4 )合并为步骤(31):对步骤(2 )的RNA进行逆转录反应， 在同 一个反应体系中立即对cDNA产物进行环介导的等温核酸扩增反应，反应 温度为60 ~ 65°C,反应时间共为10 - 60分钟。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术检测新城疫病毒的方法，所述的检测样 本选自下列样本中的一种或者组合(1) 禽类的气管、脑、肺、脾、肠、肾或胃；(2) 禽类的喉头拭子或肛门拭子；或者(3) 禽类的胚胎培养物或细胞培养物。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术检测新城疫病毒的方法，所述的方法的 步骤(6)所述的检测是通过扩增产物凝胶电泳、扩增产物浊度观测或扩增产物化学发光检测的方法进行的。本专利技术提供的新城疫病毒的检测方法，采用的引物灵敏度高、特异性强； 采用的环介导等温扩增反应，反应时间短、操作简单。本专利技术还提供一种检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒，所述试剂盒包含 有引物，所述的引物与新城疫病毒的核苷酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在DNA聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核酸序列的一部分。作为本专利技术优选实施方式，本专利技术的检测生物样品中新城疫病毒的试剂盒包含有引物，所述引物为如下序列号1 序列号6所示的寡核苷酸，序列号1 CTGCAGGAATTGTAGTAACAGG， 序列号2 ACGTGGACACAGACCCTT,序歹'J号3TGGGCATATTCGGi AGCAACTTGCAGTCAATGTi TACACCTCGT ， 序歹'J号斗 GTGCAAi AGCCCCATTGGAGGAATTCCTTGCGGATi GAGTCGC ， 序列号5 CTATGATTGACCCFGTCTGAG， 序歹'J号6 CTACTTTGCTCACTCCTCTTG;或者序列号1-序列号6所示的寡核苷酸的互补链。上述序列号1~6的引本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测新城疫病毒的引物，其特征在于，所述的引物与新城疫病毒的核酸序列的一部分或其互补链互补，并能够在ＤＮＡ聚合酶的作用下特异性地扩增新城疫病毒的核苷酸序列的一部分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：曹永长，李强，薛春宜，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]