本发明专利技术涉及Ｂ－ＲＡＦ激酶抑制剂易感性的诊断检测。本发明专利技术提供了检测ＢＲＡＦ中的突变的方法和试剂，以及选择可用Ｂ－Ｒａｆ激酶抑制剂例如选择性的Ｂ－Ｒａｆ激酶抑制剂进行治疗的患者的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测BRAF中的突变的方法和试齐搶。
技术介绍
6藩基因编码B-Raf， 一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其用于耦f^人激舌RAS 至下游MAPK激酶的信号传导(Wellbrocke^/., C朋cer他乂 64: 2338-2342， 2004)。 B-Raf中的癌基因突变将导致激酶功會紛皮获得(gain-of-kinase-fimction)， 从而导致在典型生长因子缺乏情况下Raf-MEK-ERK途径的组成性激活。该组 成性激活与转移性黑素瘤预后较差相关(Houben " W.， 2004，滞/7ra)。说MF 中的激活突变在多种恶性肿瘤中已有报道。例如，说MF中的突变在多达70% 的人黑素瘤病例中被发现。外显子15第600密码子核苷酸位置1799的单 突变(》A)，导致缬氨輕谷氨酸取代(V600E)，该取代在85 %以上的具有B-Raf 中的突变的黑素瘤中存在(Davies"a/., Atow陀417: 949-954， 2002; Gamettand Marais， Q cerCe//6: 313-319， 2004; Gray陽Schopferefa/., C朋ce7-她toto57》7 ev. 24: 165-183， 2005; Houben etal.， 2004)。不太常见的是，V600E突变由核苷 酸位置1799-1800的两石JIS突变TG〉AA产生(Houbenef, JCara"og， 3: 6， 2004)。许多激W^制剂是己知的，包括抑制B-Raf的那些抑制剂。这样的抑制剂 包括？1^4032，其选择性抑制8-1131^60(^激酶活性。本专利技术提供了鉴定￥600￡-阳性患者以选择用于采用B-Raf激,制剂，例如PLX4032进行的治疗的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了对可用B-Raf激謝卬制剂进行治疗的候选患者进行检观啲方 法和组合物。因此， 一方面，本专利技术提供了鉴定癌细M B-Raf抑制剂敏感性 的方法，该方法包括(i)提供来自癌症患者的癌细胞的核酸样品；(ii)用扩增 靶多核苷 歹啲弓嫩对，对核酸样品中的靶多核苷齢列进行扩增，其中所述耙多核苷酸序列包括说MF中的V600E突变位点，并且所述扩增在标记的寡核苷酸探针存在下进行，其中所述标记的寡核苷酸探针包括SEQ ID NO: 1所 示序列的至少15个B比连的(contiguous)核苷酸，其检测说MF中V600E突变 位点上的突变序列的存在；以及(iii)检测S，中V600E突变是否存在；由此 确定该癌症对B-Raf抑制剂的敏感性。在某些实施方式中，^^针具有如SEQID NO: 1所示的核苷,列。扩增可以在第二探针存在的情况下进行，所述第二 探针检测在V600E突变位点的野生M^歹啲存在。在某些实施方式中，第二探 针包括SEQIDNO: 2的至少15个核苷酸。在某些实施方式中，第二探针具有 SEQIDNO: 2所示的核苷,列。在某些实施方式中，^^针可以用荧光标记予 以标记。探针也可以用两种标记予以标记，其中一种标记为荧光染料，另一种 标记则为淬灭部分。在某些实施方式中，用于扩增反应的引物对的两个引物，都与SiMF的外 显子15杂交。在某些实施方式中，用于扩增反应的引物对中的一个引物，包括 SEQIDNO: 3所示核苷酸序列的至少15个耻瞎的核苷酸，例如引物对中的一 个引物具有SEQ ID NO: 3所示的核苷辦列。在进一步的实施方式中，弓嫩 对中的一个引物包括SEQ E)NO:4所示核苷,列的至少15个舭连的核苷酸。 例如，该引物可具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列。在进一步的实施方式 中，用于扩增的引物对包括具有SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示核苷酸 序列的引物。在某些实施方式中，扩增反应步骤包括RT-PCR。本方法可用于检测在B-Raf氨基酸位置600上具有突变，例如V600E突变 的癌症。在某些实施方式中，癌症为黑素瘤。在其他实施方式中，癌症为结肠 癌或甲状腺癌。在某些实施方式中，用于本专利技术方法以检测突变的核酸样品可 获自皮肤活检。在其他实施方式中，样品获自结肠活检。样品也可获自石蜡-包 埋组织。本专利技术方法可进一步包括记录这样的诊断患者对B-Raf抑制剂敏感， 例如突变体特异性B-Raf抑制齐收t!PLX4032。在某些实施方式中，本方法进一 步包括对患者给予B-Raf抑制剂。B-Raf抑制剂可以是突变体特异性B-Raf抑制 剂(mutant specific B-Raf inhibitor),如PLX4032。在另一方面，本专利技术提供了 PLX4032治疗候选患者的鉴定方法，该方^ 括提供获自个体(subject)的样品；从样品中检测含^MF V600E突变的生物^T，从而鉴定PLX4032治疗候选患者。在某些实施方式中，所述生物分子是核酸。在其他实施方式中，生物分子是多肽。多肽可以获自例如来自患者的 含癌细胞的样品。在某些实施方式中，多肽可用免疫分析进行检测。该方法也包括将PLX 4032给药至所述个体。在另一方面，本专利技术提供了检测用B-Raf抑制剂治疗的{|魏患者的试剂盒， 其中所述试剂盒包括第一等位基因特异性探针，其中所述第一探针检测说MF 中的V600E突变，并且其包含SEQIDNO: 1所示序列的至少15个耻旌的核苷 酸。在某些实施方式中，所述探针具有SEQIDNO: l所示的核苷fr游列。本 专利技术试剂盒可进一步包括第二等位基因特异性探针，其中所述第二探针检测野 生型S^4F序列，并且其包含SEQIDNO: 2所示核苷li^列的至少15个耻旌 的核苷酸。在某些实施方式中，第二^^针具有SEQ ID NO: 2所示的核苷, 列。在进一步实施方式中，本专利技术试剂盒进一步包括扩增含V600E突变位点的 ^MF靶区域的引物对。例如，弓I物对可以包括含有SEQK)NO: 3所示核苷酸 序列至少15个fflt涟核苷酸的弓嫩。在某些方面，弓嫩具有SEQIDNO: 3所示 的核苷& 列。在其他实施方式中，引物对可以包括含有SEQ IDNO: 3和SEQ ID NO: 4所示核苷,列的至少15个耻旌核苷酸的引物。在某些实施方式中， 引物对包括具有SEQIDNO: 3和SEQ ID NO: 4所示核苷酸序列的引物。因此，在某些实船式中，本专利技术的试剂盒包括具有SEQ ID NO: l所 示核苷,歹啲探针；具有SEQ ID NO: 2所示核苷鹏列的探针；具有SEQ ID NO: 3所示核苷,歹啲引物；和具有SEQH)NO: 4所示核苷辦列的引物。附图说明图1显示了B-RafV600E扩增子(SEQIDNO: 5)与染色体X相应区(SEQ ID NO: 6)的比对。B-RafV600E引物位置以箭头显示。扩增子包括外显子15 (大写字母)和内含子15 (小写字母)的部分。垂13^接线，^^F和染色 体X序列同一性的位置。密码子600被框起来；GTG对应缬氨酸(V)。探针 结合区以阴影高亮显示；突变(MU)探针t徵生型(WT)探针要长两个核苷 酸(在高亮区的5'-CT)，两个探针都结合此处所示序列的互补序列。图2显示了围绕编码子600 (箭头)的B-Raf外显子15本文档来自技高网...
【技术保护点】
确定癌细胞对Ｂ－Ｒａｆ激酶抑制剂敏感性的方法，该方法包括： －提供来自癌症患者癌细胞的核酸样品； －用扩增靶多核苷酸序列的引物对，扩增核酸样品中的靶多核苷酸序列，其中靶多核苷酸序列包括ＢＲＡＦ中的Ｖ６００Ｅ突变位点，并且扩增在标 记寡核苷酸探针的存在下进行，其中所述探针具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示序列的至少１５个毗连的核苷酸，其可检测ＢＲＡＦ中Ｖ６００Ｅ突变位点上的突变序列的存在；以及 －检测ＢＲＡＦ中Ｖ６００Ｅ突变是否存在；由此确定所述癌症对Ｂ－Ｒａｆ 抑制剂的敏感性。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：R兰兰德，T夏普，S威尔，L吴，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。