一种虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及其检测方法技术

一种虾白斑综合症病毒病检测试剂盒及检测方法，该试剂盒由一套引物、ＤＮＡ提取缓冲液、ＤＮＡ聚合酶、环介导等温扩增反应液、阳性对照、阴性对照、甜菜碱和ｄＮＴＰ组成；采用本发明专利技术可以检测出待检测虾是否感染虾白斑综合症病毒；本发明专利技术利用Ｂｓｔ　ＤＮＡ酶的链置换特性，设计４条引物，识别靶序列的６个区域，在等温条件下生成大量的茎环样结构，在定性检测时不需任何特殊设备。因此具有特异性、灵敏度高和检测时间比普通ＰＣＲ短的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测病毒的试剂盒及检测方法，具体涉及一种检测白斑综 合症病毒的试剂盒及检测方法。
技术介绍
自1993年以来，我国沿海对虾养殖业常常遭受暴发性流行病的侵袭。该 病传染性强、宿主广、致死率髙，严重制约着我国对虾养殖业的持续发展。现 已证实对虾暴发病的病原是白斑综合症病毒(WSSV)。目前WSSV已遍及亚洲 主要对虾养殖国家和地区，并已传播到北美洲。在已报道的所有对虾病毒中， 该病毒毒力最强，危害最大，南美白对虾、斑节对虾、日本对虾、墨吉对虾、 长毛对虾、中国对虾、印度对虾、桃红对虾、蓝对虾、白对虾、褐对虾、刀额 新对虫下、脊尾白奸、斑节对虾等，大部分养殖对虾皆可被WSSV侵染，在浮 游生物、海葵、糠虫下、白虾、毛虾、天津厚蟹、日本大眼蟹等动物中可检测出 WSSV，在怀池的蟹、桡足类和昆虫(Ephydridae)体内也检到过WSSV,表明 WSSV地域分布及宿主范围非常广泛，早在1995年国际兽疫局(OIE)、联合 国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将其列为 需要报告的重要的水生动物病毒病病原之一。有关WSSV的研究在病原学、病理学、流行病学以及诊断学研究方面已 深入到分子水平，但由于诸多原因，到目前为止还不能完全控制WSSV的疫 情，面对WSSV的传布所能采取最主要的措施是及早发现和消灭传染源，果 断切断传播途径。这样就需要建立和完善灵敏、准确、髙效、快捷、方便的检 测方法，现有的检测WSSV感染的方法很多，大致可以分为三类，即病原学、 免疫学以及基因组检测。用组织病理学和电子显微镜的方法来来检测WSSV耗时长，操作繁琐， 灵敏度低，极易漏检，不宜对大批样品进行检测。免疫学检测制备髙效价抗体是WSSV免疫检测的关键，其最佳方案是制备单克隆抗体。wssv的单克隆抗体免疫检测，其特异性、灵敏性和可重复性大大提髙，方法快速、灵敏、简单、低成本，在实验条件一般的实验室内均能 进行，但这类方法的发展落后于现代分子生物学技术。通过基因组来检测，以WSSV的特有序列为耙序列进行检测，其中PCR 检测由于其快速而又特异，应用方便，还可以进一步衍生出巢式 PCR(nested-PCR)，但为避免假阳性结果需设置内控引物，同时因PCR反应 时间长、还需要专门的PCR仪，新近还有利用实时PCR (real-time PCR)来 检测WSSV,更是需要专用的仪器。另外还有利用核酸杂交技术，通过原位杂 交或斑点杂交来完成，原位杂交需要先制组织切片，而且此法耗时长，操作繁 琐，不适合在基层使用，斑点杂交需要把待测核酸固定于杂交膜上再行杂交、 显影，适合于批量样品操作，但仅杂交后的显影检测需15小时左右，耗时长。近年来发展起来的环介导等温扩增法(LAMP， loop-mediated isothermal amplification),该方法可以高灵敏地非常有选择性地髙效扩增靶序列(Notomi et al.， 2000),最终的LAMP产物是是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结 构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区 带组成的阶梯式图谱。LAMP是一种全新的恒温核酸扩增方法，和其它核酸扩 增技术相比，其反应原理、引物设计更加复杂。但是它具有等温扩增只需要 一个恒温装置就可以；髙效灵敏模板仅需要10个拷贝或更少；扩增特异性 强应用包含了六个区段的四条引物按严格顺序进行扩增；检测时间短扩增 可以在90min完成，比普通PCR反应还要省时间；产物可以通过直接在反应 管中加SYBRGreenI染色(由橙色转为绿色)或用琼脂糖凝胶电泳检测。因 此LAMP在核酸的科学研究、疾病的诊断和预防、动物胚胎的性别鉴定和转 基因食品检测等领域得到了日益广泛的应用。2004年Tomoya Koiio将WSSV 从kuruma shrimp中纯化出来，再提取WSSV的核酸，利用LAMP技术对此 核酸进行扩增，结果证实LAMP可用于WSSV相应序列的扩增；但是该方法 对中提纯步骤复杂而且对设备要求髙，设备昂贵，适用性不普遍，另外，LAMP 技术应用到实际检测中，还需要解决的问题包括引物的设计和实验条件的优 化。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种检测虾wssv的试剂盒及检测方法，简化检测步骤，縮短检测耗时，同时提髙检测的灵敏度和特异性。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是 一种环介导等温扩增检测虾 白斑综合症病毒病(WSSV)的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其中 一对外引物由前外引物F3-131和后外引物B3-131组成； 一对内引物由前内引 物FIP-131和后后内引物BIP-131组成；所述前内引物FIP-131包含F1C, —个TTTT连接子和F2-131,其序列 如下所示5" -CCA GTG CAC TAT TCC CAT TAG AAG GTT TTA CCA CTC CCT TCA TTA TTG TC-3，；后内引物BIP-131包含B1C， 一个连接子和 B2-131,其序列如下所示5，-CCT TTT GCC CCT TCA GCT GAT TTT CTG AGC CAG GTG TTC TG-3，；前外引物F3-131的序列为5，-TGT GGA TGA TTA TCC TGT GTT-3，；后外引物B3-131的序列为5'-TCT CTC TGG TGA ACC CAT-3，。上述引物是根据WSSV DNA基因组序列，选取WSSV ORF131 (其 GenBaiik登录号为No. EF524223),经BLAST分析确定其保守区域且与 GenBank公布的其它核酸序列无同源，同时根据引物设计原则分别设计的， 上述引物具体涉及的6个位点如下所示901■Pa余TCTCTAGTGA CAGAGG邻GT GGATGATTAT CCTGTGT^TT CACCACTCCC TTCATTATTG AGAGATCACT GTCTCCCACA CCTACTAATA GGACACAAAA G|TGGTGAGGG RAGTAATAACl961TCACCTATGC CAGCTAGTCC ACTTJCCTTCT AATGGGAATA…GTGCACT(figlA AGATGGGGGG 國TGGATACG GTCGATCAGG TGAAGGAAGA TTACCCTTAT CACGTGACCT TCTACCCCCC■■■■B2C1021 CCTTTTGCCC CTTCAGCTGA TATTGTTGTT GATAAAACAT CAGAAATTAT GGGlC鹏AaS^！GGAAAACGGG GAAGTCGACT ATAACAACAA CTATTTTGTA GTCTTTAATA CCCGTCTTGT隐10811141ICCTGggTC"K^ AATGGGTTCA CCAGAGAGAC AGGAATAGTA AAATGGAGAT ACGAAACTAT GGACCGAGTC T,CCCAAGT G(3TCTCTCT|G TCTCATCTTA TTTACCTCTA TGCTTTGATA祭3'GGGGCAAGAG GGTCTGGTAT AAATACTGGA AGATATAGAA G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种环介导等温扩增检测虾白斑综合症病毒病的引物，由一对外引物和一对内引物组成，其特征在于：其中一对外引物由前外引物Ｆ３－１３１和后外引物Ｂ３－１３１组成；一对内引物由前内引物ＦＩＰ－１３１和后后内引物ＢＩＰ－１３１组成；　所述前内引物 ＦＩＰ－１３１的序列如下所示：　５’－ＣＣＡ　ＧＴＧ　ＣＡＣ　ＴＡＴ　ＴＣＣ　ＣＡＴ　ＴＡＧ　ＡＡＧ　ＧＴＴ　ＴＴＡ　ＣＣＡ　ＣＴＣ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＴＴＡ　ＴＴＧ　ＴＣ－３’；　后内引物ＢＩＰ－ １３１的序列如下所示：　５’－ＣＣＴ　ＴＴＴ　ＧＣＣ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＴＴＴ　ＣＴＧ　ＡＧＣ　ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＴＴＣ　ＴＧ－３’；　前外引物Ｆ３－１３１的序列为：５’－ＴＧＴ　ＧＧＡ　 　ＴＧＡ　ＴＴＡ　ＴＣＣ　ＴＧＴ　ＧＴＴ－３’；　后外引物Ｂ３－１３１的序列为：５’－ＴＣＴ　ＣＴＣ　ＴＧＧ　ＴＧＡ　ＡＣＣ　ＣＡＴ－３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：薛仁宇，贡成良，曹广力，张伟明，魏育红，沈卫德，顾金寿，杨贺，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]