核酸的定量方法技术

本发明专利技术提供一种核酸的定量方法。本发明专利技术提供的方法是克服以往的方法的缺点、新型简便的ＤＮＡ定量分析方法。本发明专利技术的方法中，制备在靶ＤＮＡ中导入有单碱基置换的标准ＤＮＡ试样，将一定量的该试样与靶ＤＮＡ试样混合，用相同的引物扩增靶ＤＮＡ和标准ＤＮＡ，使其包含所述单碱基置换部位，使用结合于所述单碱基置换部位前一个部位的探针，将ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ一种一种地顺次加入，进行互补链合成反应，通过荧光素酶反应检测来自生成的焦磷酸的发光，由检测的发光量和加入的标准ＤＮＡ试样的量来对靶ＤＮＡ进行定量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA和RNA的定量分析方法。
技术介绍
基因的表达量的调查，在医药开发或疾病的因果关系的调查上是很重要的 事项。但是，以DNA为中心的生物领域中，多数情况是，作为靶物质的DNA 的拷贝数通常很少，要将其扩增来计测，对于正确求得其拷贝数的需求正在增 大。作为现在使用的代表性的DNA定量方法，可以举出(1)电泳法、(2) DNA微阵列法(专利文献l)、 (3)实时定量PCR法(非专利文献l) 3种。 其中，电泳法是，电泳分离带负电的DNA,将分离的标准试样和靶试样的带 染色，调查其强度比的定量方法。该方法的解析成本低，但缺点是定量精度低。DNA微阵列法是，使以不同荧光体标记的靶试样和标准试样，与固定有 具有互补序列的低聚核苷酸或cDNA的DNA芯片竟争杂交，调查荧光强度比 的定量方法。该方法能够一次定量多达数万个基因，但得到的荧光强度比容易 受到基因序列的2级结构和交叉杂交的影响。所以，该方法的缺点是定量精度 差，并且解析(装置、DNA芯片、试剂)需要高额费用。另一方面，实时定量PCR法是， 一边同时PCR扩增靶试样和标准试样， 一边观测试样发出的荧光，由PCR产物达到一定量时的PCR循环数来定量初 始存在的靶试样的量的方法。作为调查PCR产物的手段，有使用SYBR GREEN 的嵌入剂(intercalate!")法、或使用基因特异性探针的所谓TaqMan探针法。 所谓该TaqMan探针，是通过DNA探针连接消光原子团和荧光原子团得到的 物质，最初其自身不发出荧光，但随着PCR扩增的进行，探针部分分解，游 离的荧光原子团发出荧光。该方法的定量精度比较高，^f全测下限也低至几分子 的程度。但是，实时监测PCR扩增过程，需要昂贵的装置，并且在解析前必 须制作具有相同序列的标准试样的稀释系列(至少5个不同浓度)，每次必须与靶试样同时进行实时解析，存在操作烦瑣、需要时间和劳动力的问题。专利文献1:日本特开2004-33160号公报非专利文献1: Higuchi R， et al, Bio. Techology, 10: 413-417, (1992)
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的课题是，提供克服以往的DNA定量方法的缺点的新型简便的 DNA定量法。解决问题的手段为了解决上述问题，本专利技术中，使用3'末端附近加入单碱基错配(单碱基 置换)的引物来扩增作为定量对象的靶DNA的一部分，制备具有与耙DNA 1'又有1石威基序歹。不同的序歹'j的"才示准DNA i式才羊"。才示〉偉DNA是向輩巴DNA的至 少一部分(例如作为解析对象的区域)导入了单碱基错配的DNA。将一定量的制备好的标准DNA试样与靶DNA试样混合。PCR扩增该混 合的DNA试样后，进行定量分析，这时使用的PCR引物按照标准试样制成时 导入的单碱基置换部分被包含在扩增区域中来设计。通过PCR扩增的区域的 序列为，除人为导入的单碱基置换部分以外全部是相同的序列，靶DNA和标 准DNA可以在保持其比例的状态下同时进行扩增。得到的扩增产物单链化后，计测单碱基置换部分的碱基的存在比，由加入 的标准DNA试样的量和该存在比求出耙DNA的量。单碱基置换部分的存在 比如下计测进行使用终止子ddNTP的互补链合成反应，将作为该反应的副 产物的焦磷酸转换为ATP,检测以ATP为底物的荧光素酶引起的发光。互补 链合成反应所使用的探针是按照其3'末端在置换部分前一个部位来设计的。 即，最初获取的核酸底物的模板为单碱基置换部分的碱基种类。互补链合成所使用的4种核酸底物为ddATP、 ddCTP、 ddGTP和ddTTP， 这些顺次加入反应槽，观察发光。这里，预先测定各ddNTP对于一定量的模 板的发光强度，确定各碱基间的发光强度比。从而，通过比较对各核酸底物的 发光强度，来得知置换部分的碱基的存在比(即，标准DNA和靶DNA的存 在比)，可以由标准DNA试样的量来定量分析靶DNA。即，本专利技术涉及，所述方法包括(l)在靶DNA试样中混合一定量的标准DNA试样的工序，所述标准DNA试样是在所述耙DNA的 至少一部分中导入单碱基置换而得到的；(2)使用引物扩增混合后的试样的工 序，所述引物被设计成用于扩增包含所述单碱基置换部位的区域；(3)将扩增 后的试样单链化，使其与结合于所述单碱基置换部位前一个部位的探针杂交， 将ddATP、 ddGTP、 ddCTP、 ddTTP—种一种地顺次加入，进行互补链合成反 应的工序；(4 )通过荧光素酶反应检测来自所述互补链合成反应中生成的焦磷 酸的发光的工序；(5)由检测的发光量和所述标准DNA试样的量来定量靶 DNA的工序。某实施方式中，对置换碱基不同的多个标准DNA试样进行所述(1 ) ~ ( 5 ) 的工序。另外，在别的实施方式中，对浓度不同的多个标准DNA试样进行所 述(i) (5 )的工序。本专利技术的方法中，通过对PCR扩增所使用的引物预先进行生物素标记， 使得可以使用链霉亲和素结合微珠来精制扩增产物。作为靶DNA试样，可以使用由mRNA逆转录得到的cDNA试样等。如 果预先向靶DNA附加锚定序列，则可以使用在该锚定序列中导入有单碱基置 换的引物来制备标准DNA试样。本专利技术的方法中，靶DNA和标准DNA可以是游离的状态，也可以是被 固定在固相表面的状态。例如，如果将靶DNA试样固定于-兹微珠，则可以容 易地进行其精制、再利用。专利技术的效果根据本专利技术，使用靶DNA试样的一部分，通过PCR扩增，可以简单地制 作标准DNA。定量分析中利用的是利用了荧光素酶反应的发光反应，但互补 链合成中使用的ddNTP与dNTP (特别是dATP)不同，不作为荧光素酶反应 的反应底物，因此没有背景发光，并且因为没有获取2碱基以上的核酸底物， 因此可以正确测定。进而，由于发光量与DNA量成线性比例，因此能够进 行精度高的定量。另外，由于可以独立进行PCR扩增和发光反应的计测，因 此本专利技术中使微量的试样DNA大量PCR扩增后，可以高效进行分析。顺便说 一下，本专利技术中，从加入ddNTP后开始到计测结束为止需要的时间为数分钟， 与实时定量PCR相比，可以在短得多的时间内进行定量分析。如后所述，如5果准备浓度不同的多种标准DNA试样，则能进行更精确的定量。因为发光的 计测中可以使用将廉价的照度计改造而得到的仪器、或者具备光二极管的廉价 的光检测器，不需要焚光探针等昂贵的试剂，因此整体上廉价的定量分析成为 可能。即，对于以往方法中难以实现的(i)高定量精度、(ii)廉价的解析装置、 (iii)低试剂成本、(iv)筒便的解析操作，根据本专利技术，全部可以实现。 附图说明图1是本专利技术的方法的基本程序。 图2是靶DNA试样的结构。图3是靶DNA试样和标准DNA试样的混合以及PCR扩增。 图4是单碱基延伸和发光强度的测定。 图5是发光强度信号的算出。图6是发光强度比的算出(使用3种标准DNA的情况)。符号说明201mRNA202cDNA203要解析的DNA扩增区域204反向引物引发部位205正向引物引发部位301耙DNA试样302标准DNA ( A )303标准DNA (B )304标准DNA ( C )305混合试样306正向引物E3075'末端生物素本文档来自技高网...

【技术保护点】
核酸的定量方法，其包括以下工序：　（１）在靶ＤＮＡ试样中混合一定量的标准ＤＮＡ试样的工序，所述标准ＤＮＡ试样是在所述靶ＤＮＡ的至少一部分中导入单碱基置换而得到的；　（２）使用引物扩增混合后的试样的工序，所述引物被设计成用来扩增包 含所述单碱基置换部位的区域；　（３）将扩增后的试样单链化，使结合于所述单碱基置换部位前一个部位的探针杂交，将ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰ一种一种地顺次加入，进行互补链合成反应的工序；　（４）通过荧光素酶反应，检 测来自在所述互补链合成反应中生成的焦磷酸的发光的工序；　（５）由检测的发光量和所述标准ＤＮＡ试样的量来定量靶ＤＮＡ的工序。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：谷口妃代美，神原秀记，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]