一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒及检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒，包括四组杂交探针、标记物，所述的杂交探针分别具有序列表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４所示的序列。本发明专利技术还提供了一种ＰＡＸ９基因、ＮＫＸ２－８基因、ＴＴＦ１基因和ＲＨＯＧＤＩ２基因原位杂交检测方法。另外，本发明专利技术还提供了试剂盒在制备检测肺癌早期诊断、转移、复发疾病药物中的应用。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

【技术实现步骤摘要】
一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒及检测方法和应用
本专利技术涉及一种试剂盒，具体地说关于一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒 及检测方法和应用。
技术介绍
根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数170万，死亡 人数近160万，患者600万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800 万，患者约有8400万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度 报告，"认为人类在抗癌大战中是失败"，也就是说癌症死亡率没有降低，其列 举出造成抗癌大战失败的几个因素是1.肿瘤细胞异质性；2.肿瘤细胞耐药性； 3.抗癌药物设计思路不完善等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌 症的措施。本专利技术人在研究中发现，导致癌症死亡率不降的另二个重要原因是l.不 能做到真正的早期诊断;2.转移的病理机制不清楚。依照传统的医学影像及和 其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性癌块在2公分下是属 于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一概念值得认真讨论。影像 医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度， 1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远 不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块， 其病理演变过程相当长，可能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶。临床上己证实 一旦形 成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他部位克隆生长； 一旦切除 原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此，在临床上以 2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病 灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时己经是晚期了，这 是导致癌症死亡率不降的真正原因。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入 展开，至今，我们己有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或 癌细胞形成(单克隆时)就能做到早期预测诊断。PAX9、 NKX2-8、 TTF1、基因被认为是致肺癌的协同基因，PAX9、 NKX2-8、 TTF1、基因的表达增高，表示病人已患肺癌且多数已转移。美国冷泉港实验室 的科学家发现了位于人类第14号染色体上PAX9、 NKX2-8、 TTF1、基因有协同 致肺癌发生和导致转移，进一步研究表明PAX9、 NKX2-8、 TTF1、基因能再激活 一种早期的胎儿基因表达模式，导致肺癌产生和转移，PAX9、 NKX2-8、 TTF1 基因与20%肺癌癌变有关，他们发现这些基因的异常变化在晚期肺癌更常见， 有可能是癌症复发的危险因子。弗吉尼亚大学的泌尿学与分子生理学教授Dan Theodorescu博士领导的科 学小组研究表明，RhoGDI2基因与癌细胞转移有关系，当RhoGDI2基因在癌细 胞中有活性时，细胞就产生一种能够阻止癌细胞浸入到其他器官的蛋白，该项 研究发表在2006年11月15日期的《癌症研究》(《cancer research"杂志 上。本专利技术人在对大量样本——广泛性腺癌(肝、肺、肾、胃、子宫、卵巢、 乳房、直肠等组织细胞)检测中观察到，肝癌病人伴有转移者，RhoGDI2基因 表达量降低或零表达，该指标有重要的临床价值。RhoGDI2基因表达量降低或零表达，证明肝癌己转移和复发。RhoGDI2基因已被公认为肿瘤转移抑制基因， 我们在研究中证实RhoGDI2基因与癌症转移密切相关，而且具有广谱性。我们 检测了近800例各种类型癌症患者(大部分已转移)血液标本，近800例正常 对照组人群，经统计学分析，癌症患者体内RhoGDI2基因表达量为8。/。左右，正 常人群表达量平均为50%，病例组中有600多例该基因是零表达。同时检测两 个家族性癌症好发家属的直系亲属，该基因的表达量比正常人表达量都低。 目前对PAX9、 NKX2-8、 TTF1、 RH0GDI2基因的研究都采用高通量基因芯片技术，而这一方法多用于科研方面，不适应临床应用，特别是个性化的应用在 我国现阶段条件尚不成熟。根据现有的文献资料及査新报告PAX9、 NKX2-8、 TTF1、 RH0GDI2基因的检测技术未见报道。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术 结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的 技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条 件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分 子。中国专利文献CN1556221公开了"IC53基因及其相关产物诊断和治疗结肠 癌的用途及一种诊断结肠癌的试剂盒"。中国专利文献CN1769485公开了 "栉 孔扇贝病原类立克次氏体的原位杂交检测方法及其试剂盒"。中国专利文 献CN1556410公开了 "一种鱼类病毒的检测试剂盒及其检测方法"。中国专利 文献CN1680597公开了"一种用于定量检测丙型肝炎病毒(HCV)的荧光定量PCR 试剂盒"。中国专利文献CN2918435，公开了 "一种检测肥胖相关基因SNP的寡 核苷酸芯片及试剂盒"。但是，关于肺癌原位杂交综合检测试剂盒及检测方法未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒及 检测方法和应用。能够检测早期肺癌，或者在治疗后能及早地预测转移复发状 况。为了解决上述问题，本专利技术提供了一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒，包括四组杂交探针、标记物，所述的杂交探针分别具有序列表SEQ ID NO. 1， SEQ ID NO. 2， SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的序列。PAX9基因序列见SEQ ID NO. 1所示的序列。PAX9基因的核苷酸序列长度是3113bp， CDS是 718.. 1743，位于染色体14ql2-ql3"位点上。NKX2-8基因序列见SEQ IDN0.2所示的序列。NKX2-8基因的核苷酸序列长度是1857bp， CDS是 193...912，位于染色体14ql3.3位点上。TTF1基因序列见SEQ ID NO. 3 所示的序列。TTF1基因的核苷酸序列长度是2202bp， CDS是83. . . 1288 bp，位于染色体14q位点上。RhoGDI2基因序列见SEQ ID NO. 4所示的序列。RhoGDI2基因的核苷酸序列长度是1216bp，CDS: 105.....710bp，位于染色体12p3位点上。作为可选的技术方案，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1， SEQ ID NO. 2， SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的RNA序列。作为可选的技术方案，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。 作为可选的技术方案，所述的放射性核素选自3H、 35S、 125I或32P中的一种。 作为可选的技术方案，所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性 磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肺癌原位杂交综合检测试剂盒，包括四组杂交探针、标记物，其特征在于：所述的杂交探针分别具有序列表ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４所示的序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张云福，裘建英，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]