一种体外构建DNA文库的方法技术

本发明专利技术描述了通过在多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同的起始ＤＮＡ模板和引物体外构建重组同源多核苷酸基因文库的一种方法，其中：Ａ．通过ａ）ＤＮＡ模板变性，ｂ）将引物与模板退火，ｃ）使用聚合酶延伸上述引物，ｄ）终止合成，及ｅ）从模板中分离延伸的引物来合成延伸的引物；Ｂ．通过ａ）从模板中分离延伸引物并使用延伸引物作为引物和模板重复Ａ．ｂ）至Ａ．ｅ）步骤，或ｂ）重复Ａ．ｂ）至Ａ．ｅ）步骤来诱导模板移位，Ｃ．在适当数量循环的步骤Ａ．和Ｂ．ａ），Ａ．和Ｂ．ｂ），或其组合的过程后终止此过程。可选择地在使用特定引物的标准ＰＣＲ反应中扩增多核苷酸，以选择性扩增感兴趣的同源多核苷酸。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术的领域本专利技术涉及优化DNA序列以(a)通过使用称为基因或DNA改组技术产生“基因”的大容量库人工产生有遗传差异的编码感兴趣蛋白的基因，在适当的表达系统中表达上述基因文库并依据特定特征筛选表达的蛋白以确定表现所需特征的蛋白质，从而改进感兴趣蛋白质的特性或(b)通过产生元件文库，与结构基因可操纵连接后转化适当的宿主，表达上述结构基因并筛选调节元件中的所需特征，从而改进诸如启动子或终止子等调节元件的特性。本专利技术的背景在不同属之间，常发现行使特定生物活性的蛋白质表现出一定差异，甚至在同一种的个体间也存在差异。这种差异当然更多的在基因组水平得以表现。这种编码基本具有相同生物活性蛋白质的基因之间的天然遗传差异是在亿万年中自然产生的，反映了相对于所研究生物体的环境而产生的编码蛋白的自然优化。在当今社会中，生活环境大大脱离了自然环境并且已经发现在人类将它们用于不同用途特别是用于工业目的是，天然产生的生物活性分子并没有最优化。因而确认依据所需用途表现最优化特征的那些生物活性蛋白质就成为工业兴趣。这已经在许多年来通过筛选天然资源，或使用诱变进行。例如，在将酶用于例如洗涤剂的
，通过酶的体外修饰，显著改进了例如天然产生的蛋白酶，脂酶，淀粉酶和纤维素酶的洗衣和/或洗碟应用。在多数情况下，这些改进是通过定点突变产生依据类型或在成熟酶二级或三级结构中的定位选择的特定氨基酸残基的替代，缺失或插入获得的(参看例如US patent no.4,518,584)。以这种方式，成功制备了新的多肽变种和突变体，诸如具有改变特性，例如专一活性，底物活性，热，pH和盐稳定性，最适pH，pI，Km，Vmax等的新修饰酶，以获得具有改进特性的多肽。例如，在酶
，例如蛋白酶，脂酶，淀粉酶和纤维素酶的洗衣和/或洗碟应用得到显著改进。修饰蛋白质和酶的另一种方法基于随机突变，例如，如US4,894,331和WO93/01285中所述。由于获得具有改进功能特征的多肽变种或突变体是麻烦和费时的过程，建议了一些快速制备修饰多肽的其它方法。Weber等(1983)在核酸研究(Nucleic Acids Research)，vol.11，5661中描述了一种通过同源基因间体内重组修饰基因的方法。构建了含有质粒载体并在5’末端侧翼有编码α-1人干扰素的DNA序列，在3’-末端侧翼有编码α-2人干扰素的DNA序列的一段线性DNA序列，并转染到rec A阳性大肠杆菌菌株。使用抗性标记确认和分离重组体。Pompon等(1989)在Gene 83，p.15-24中描述了一种改组哺乳动物细胞色素P-450基因域的方法，将使用具有补平末端的线性质粒转化酿酒酵母产生的酿酒酵母中的部分同源序列与和上述质粒末端部分同源的DNA片段进行体内重组。在WO97/07205中描述了一种方法，利用使用质粒性DNA作为模板的体内重组，通过改组同源性DNA序列的不同核苷酸序列制备多肽变体。美国专利No.5,093,257(AssigneeGenencor Int.Inc.)中公开了一种通过体内重组产生杂合多肽的方法。通过形成含有一个复制序列，编码杂合多肽氨基末端部分的第一段DNA序列，编码上述杂合多肽羧基末端部分的第二段DNA序列的环状载体产生杂合DNA序列。将环状载体转化到rec阳性微生物并在其中扩增环状载体。这样通过rec阳性微生物，包括诸如芽胞杆菌和大肠杆菌等原核生物和诸如酿酒酵母等的真核生物中天然发生的重组机制介导产生了上述环状载体的重组。Stemmer描述了一种改组同源DNA序列的方法(Stemmer，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol，91，10747-10751；Stemmer，(1994)，Nature，vol.370，389-391)。该方法涉及通过使用体外PCR技术改组同源DNA序列。基于表达蛋白的改进功能从DNA文库中筛选含有改组DNA序列的阳性重组基因。上述方法亦描述于WO95/22625。WO95/22625涉及一种改组同源DNA序列的方法。WO95/22625中描述方法的一个重经步骤是将同源模板双链多核苷酸切割成所需大小的随机片段，随后将片段同源重装配成全长基因。然而，WO95/22625中方法的内在缺点是由于使用同源基因序列，通过该方法产生的多样性是有限的(如WO95/22625中所述)。WO95/22625方法中另一个缺点在于通过切割模板双链多核苷酸产生随机片段。感兴趣的另一个参考是WO95/17413描述的一种通过重组称为设计元件(DE)的特定DNA序列改组基因或DNA的方法，通过重组合成的双链片段或重组PCR生成的序列产生至少含有两个设计元件的所谓功能元件(FE)。依据WO95/17413中所述的方法，重组必须发生于含有具有足够序列同源性的DNA序列的设计元件之间，以使不同的序列杂合重组。因而WO95/17413亦具有缺点，产生的多样性是相对有限的。此外，描述的方法是费时的，昂贵的，并且不适于自动化。尽管存在上述方法，仍需要更好重复性的体外重组方法以制备新的多肽变体。这种方法亦应能以小体积进行，并适于自动化。本专利技术的总结本专利技术主要涉及在体外DNA合成中利用新合成DNA链的模板移位(template shift)以获得DNA改组。使用这一技术，可能更方便地获得这种结果，并且在某种程序上比上述方法有更多的变异。本专利技术的方法亦十分适于匹配自动化。在一个优选实施例中，将该技术与易出错聚合酶组合以在产生的文库中引入更多的变异。更特定地，本专利技术涉及通过在使用聚合酶的体外多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同起始单或双链亲代DNA模板和引物构建重组同源多核苷酸文库的方法，其中A.通过下面方法合成延伸的引物或多核苷酸a)将亲代双链DNA模板变性产生单链模板，b)将上述引物与单链DNA模板退火，c)使用上述聚合酶通过起始合成延伸上述引物，d)进行合成的抑制，并e)将双链变性从模板分离延伸的引物，B.通过下列步骤诱导模板移位a)从模板分离新合成的单链延伸引物并使用(A)中产生的上述延伸引物作为引物和模板重复步骤(A.b)至A.e)，或b)重复步骤A.b)至A.e)，C.在适当数目循环的步骤A.和B.a)，A.和B.b)，或其组合后终止上述过程，并且D.可选择地使用特定引物在标准PCR反应中扩增产生的多核苷酸以选择性扩增感兴趣的同源多核苷酸。在特定实施例中，本专利技术的工艺可以有各种修饰。例如使用有缺陷的聚合酶是有利的，或使用易出错聚合酶引入与模板相比较的突变，或使用能过早中断多核苷酸合成的聚合酶以抑制反应。下面将描述其它的修饰。本专利技术的另一方面涉及鉴定与具有相同生物活性天然多肽相比显示改进特性的多肽的方法，其中将通过上述过程产生的重组同源多核苷酸文库克隆到合适的载体，然后将上述载体转化到合适的宿主系统，表达成相应多肽并展示，然后在合适的检测中筛选上述多肽，并选择阳性结果。本专利技术的进一个方面涉及产生上面过程确定的感兴趣多肽的方法，其中将含有编码上述多肽的多核苷酸的载体转化到适当的宿主，培养上述宿主以表达上述多肽，回收并纯化多肽。最后，本专利技术的另一个最后方面涉及一种重组/改组蛋白，它是通过依据本专利技术的任何方法可获得的本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过在使用聚合酶的体外多核苷酸合成中诱导的模板移位从一系列不同的起始单或双链亲代ＤＮＡ模板和引物构建重组同源多核苷酸文库的一种方法，其中Ａ．通过下面方法合成延伸引物或多核苷酸ａ）将亲代双链ＤＮＡ模板变性产生单链模板，ｂ）将上述引 物与单链ＤＮＡ模板退火，ｃ）使用上述聚合酶通过起始合成延伸上述引物，ｄ）引起合成的抑制，并ｅ）将双链变性，从模板分离延伸的引物，Ｂ．通过下面方法诱异模板移位ａ）从模板分离新合成的单链延伸引物并使用（Ａ）中产生的上述延伸引 物作为引物和模板重复步骤Ａ．ｂ）至Ａ．ｅ），或ｂ）重复步骤Ａ．ｂ）至Ａ．ｅ），Ｃ．在适当数目循环的步骤Ａ．和Ｂ．ａ），Ａ．和Ｂ．ｂ），或其组合后终止上述过程，并且Ｄ．可选择地使用特定引物在标准ＰＣＲ反应中扩增产生的多核苷酸以选择 性扩增感兴趣的同源多核苷酸。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：杰斯珀文德，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]