用于鉴定酰胺化多肽激素前体的寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及新的寡核苷酸及其作为鉴定编码酰胺化多肽激素前体的ｍＲＮＡ的探针、和由此作为鉴定新的酰胺化多肽激素的探针的用途。本发明专利技术还涉及所公开核苷酸序列的寡核苷酸和用于鉴定酰胺化激素前体的方法。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及新的寡核苷酸及其作为鉴定编码酰胺化多肽激素前体的mRNA的探针的用途，并涉及鉴定新的酰胺化多肽激素的方法。因此，本专利技术涉及寡核苷酸(下文中描述了其核苷酸序列)及其用于鉴定激素前体的方法。酰胺化多肽激素合成为前体形式，该前体要进行成熟化。这一成熟过程包含酰胺化反应。C-末端的酰胺化反应是酰胺化多肽激素的特征性反应。这一在1或多个激素前体上发生的反应使激素成熟，并保证它在生理环境中的生物稳定性所形成的酰胺基团比游离的酸官能团更不易受攻击。因此，激素更能抵抗羧肽酶，它在细胞中的活性将维持更长时间并能保持对受体位点的最佳亲和力。对于酰胺化已有广泛的描述(“肽酰胺化”，Alan F.Bradbury和Derek G.Smyth，TIBS16112-115，1991年3月以及“催化肽酰胺化第二步反应之肽基酰胺甘醇酸酯裂解酶的功能和结构鉴定”，A.G.Katopodis，D.S.Ping，C.E.Smith和S.W.May，生物化学30(25)6189-6194，1991年6月)，其作用机制如下1-由内切蛋白酶在两个碱性氨基酸，即精氨酸和/或赖氨酸间切割激素的前体肽链，2-随后由羧肽酶切割两次，最终产生延伸的甘氨酸中间体，3-酶PAM(肽基甘氨酸-α-酰胺化单加氧酶)包含两种不同的酶促活性首先，它将延伸的甘氨酸中间体转化为α-羟基甘氨酸衍生物，参与该步的酶PAM亚基是PHM(肽基甘氨酸-α-羟基化单加氧酶)。所得衍生物作为PAM第二个亚基(称为PAL肽基-α-羟基甘氨酸-α-酰胺化裂合酶)的底物，PAL将甘氨酸的胺官能团固定到紧邻N-末端的氨基酸上，并释放乙醛酸。这个反应涉及存在位于激素前体上的识别位点，该位点总包含以下序列甘氨酸和两个碱性氨基酸(精氨酸或赖氨酸)(参见A.G.Katopodis等，生物化学，30(25)，6189-6194，1991年6月，以及该文的引用文献)。已知将要分泌到内质网外的酰胺化多肽激素包含一个大约15到30个氨基酸的共有信号肽序列，该序列位于多肽链的N-末端。它在后来被信号肽酶切割下来，因此分泌出来的蛋白质中没有该序列(参见F.Cuttitta，The Anatomical Record，236，87-93(1993)以及该文的引用文献)。目前，要发现一种新蛋白质是不容易的。可以通过各种技术分离和纯化蛋白质等电点沉淀、用某些溶剂选择性萃取，然后经结晶、逆流分配、吸附、分配或离子交换层析、电泳等来纯化。但是，这些技术要求知道待分离蛋白质的特性。而且，如果得到了一种治疗水平的新目的蛋白质纯样品，要得到能合成该蛋白质的基因修饰的微生物还有多个阶段。本专利技术提出的方法，通过使用目前已知的所有酰胺化激素前体的肽序列特征，具有能同时检测多种新的这类激素的优点。通过直接在从能合成这些激素前体的组织制备得到的cDNA文库中鉴定编码所述前体的核苷酸序列，可完成这种检测。用该方法进行寻找受到的限制比上面提到的常规生物化学技术小得多，因为这种方法-可以通过相同的原理分离到存在于同一组织中的几种不同前体。-能在相同的技术条件下检测具有迥异的生化和生物学特性的激素的前体。-能同时鉴定包含在同一前体中的所有肽类激素。因此，在那些研究和开发费用在销售额中占据非常高比例的领域中，本专利技术能够显著地节约时间和财力。利用本专利技术还可以对哺乳动物机体内有重要生理作用的活性物质激素以及特别是酰胺化多肽神经激素进行药理学研究。一旦首次获得活性物质所对应的cDNA，就可能通过基因工程用克隆载体经由微生物来合成具有治疗用途的激素。本专利技术首先涉及单链寡核苷酸OX，它能在温和的条件下与序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY杂交，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表2个有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。核苷酸是RNA或DNA的单体，它具有核苷磷酯的化学结构。嘌呤碱基(嘌呤，腺嘌呤、鸟嘌呤或其类似物)或嘧啶碱基(嘧啶，胞嘧啶、尿嘧啶或其类似物)与核糖或脱氧核糖结合就产生核苷。寡核苷酸是核苷酸的聚合物，表示引物序列、探针或者RNA或DNA片段。可以通过合成来获得上述寡核苷酸，以下出版物中有一篇文献描述了一种自动合成方法“DNA合成”，S.A.Narang，四面体，39，3(1983)和“合成性寡核苷酸的合成与应用”，K.Itakura，J.J.Rossi和R.B.Wallace，生物化学年评，53，323(1984)。优选地，OX可以在严谨条件下与OY杂交。更优选地，OX可以与序列为Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY杂交。还要优选的是，OX可以与序列为Y1-Y2-Y3-Y4或Y2-Y3-Y4的寡核苷酸OY杂交。特别是，OX可以与Y5代表核苷酸序列Y6-Y7-Y8-Y9的寡核苷酸OY杂交，其中Y6代表编码Ser、Thr或Tyr的三核苷酸，Y7代表编码任意氨基酸的三核苷酸，Y8代表编码Glu或Asp的三核苷酸，Y9代表含有1到12个核苷酸的核苷酸序列。更特别的是，OX可以与没有Y1和Y9的寡核苷酸OY杂交。尤其特别的是，OX可以与下面的寡核苷酸OY杂交，其中Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3代表编码Lys的三核苷酸，Y4代表编码Arg的三核苷酸，Y5代表编码Ser-Ala-Glu的3个三核苷酸序列。该序列是通过对27个已知酰胺化位点的统计学研究确定的，由此确定出一种跨越6个位点的特定氨基酸模式Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Glu。由于遗传密码的简并性以及Gly、Arg和Ser对应的密码子(Gly有4个，Arg有6个，Ser有6个密码子)很多，利用两个顾及筒并性的步骤来构建寡核苷酸序列-利用次黄苷(这种核苷酸的氮碱基次黄嘌呤与构成DNA的4种氮碱基无选择性地配对)的某些位点。-某些位点处引入的氮碱基的性质改变，从而与所引入的不同碱基数成比例地产生许多寡核苷酸组合。本专利技术还涉及含有9到42个核苷酸、序列为Y1-Y2-Y3-Y4-Y5的寡核苷酸OY，其中Y1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3和Y4各自独立地代表编码Arg或Lys的三核苷酸，Y5代表有1到21个核苷酸的核苷酸序列或者没有Y5。优选，本专利技术涉及一种没有Y1或Y5的寡核苷酸OY。本专利技术特别涉及Y5代表核苷酸序列Y6-Y7-Y8-Y9的寡核苷酸OY，其中Y6代表编码Ser、Thr或Tyr的三核苷酸，Y7代表编码任意氨基酸的三核苷酸，Y8代表编码Glu或Asp的三核苷酸，Y9代表含有1到12个核苷酸的核苷酸序列。本专利技术更特别涉及没有Y1和Y9的寡核苷酸OY。本专利技术尤其特别涉及寡核苷酸OY，其特征在于没有Y1，Y2代表编码Gly的三核苷酸，Y3代表编码Lys的三核苷酸，Y4代表编码Arg的三核苷酸，Y5代表编码Ser-Ala-Glu的3个三核苷酸的序列。本专利技术还涉及单链寡核苷酸OZ，其特征在于含有15到39个核苷酸，并能与酰胺化多肽激素所特有的共有信号序列杂交，其中所述序列具有Z1-Z2-Z3-Z4-Z5-Z6-Z7的通式，其中Z1代表有1到12个核苷酸的核苷酸序列或者没有Z1，Z2本文档来自技高网...

【技术保护点】
单链寡核苷酸ＯＸ，其特征在于含有９到４２个核苷酸，并能在温和的条件下与序列为Ｙ１－Ｙ２－Ｙ３－Ｙ４－Ｙ５的寡核苷酸ＯＹ杂交，其中Ｙ１代表有１到１２个核苷酸的核苷酸序列或者没有Ｙ１，Ｙ２代表编码Ｇｌｙ的三核苷酸，Ｙ３和Ｙ４各自独立地代表编码Ａｒｇ或Ｌｙｓ的三核苷酸，Ｙ５代表有１到２１个核苷酸的核苷酸序列或者没有Ｙ５。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：J马狄尼兹，C高兹，
申请(专利权)人：科学研究与运用咨询公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]