复杂DNA甲基化指纹的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于组织和细胞型的表征、分类和鉴别，对组织和细胞群行为的预测，并用于对具有改变表达的基因的鉴定的方法。该方法，其特征在于：在从任何组织样品中获取的基因组ＤＮＡ中，碱基胞嘧啶（而不是５－甲基胞嘧啶）经亚硫酸氢盐溶液处理转化为尿嘧啶。利用极短的或简并寡核苷酸扩增这样处理的基因组ＤＮＡ的部分。通过杂交或聚合酶反应检测扩增片段的剩余胞嘧啶。该分析所产生的、可自动适用于处理算法的数据的量可用于得出关于所分析细胞物质的表型的结论。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1．专利
此处申请专利的方法提供一种区别诊断癌症疾病的新的可能性。它导致对癌发生和多基因遗传性疾病发病机理的更深入了解。此外，该方法也涉及对参与疾病发展的所有基因的鉴定。过去，细胞分化和高等生物的分化仍基本上未被了解。现在，该方法大大增进了这方面的了解。近年来，通过分子生物学方法学发展所很好研究的观察水平包括基因本身、RNA的基因翻译和产生的蛋白质。在个体发育过程中，基因开启，特定细胞和组织中某些基因的激活和抑制如何受控制可能与该基因或基因组甲基化的特性和程度高度有关。就此而言，假定用个别基因或基因组的改良甲基化模式表达致病情况是合理的。现有技术是一种能研究个体基因甲基化模式的方法。该方法的其它最新发展也使对极少量原材料的分析成为可能，然而，测定点的总数仍至多为两位数字，理论值范围为至少107个测定点。利用申请专利保护的方法，现在第一次有可能用任一希望数量的测定点检查基因组的任何希望的部分。因此，该方法允许对用其它任何方法都不能确定的所有类型遗传性疾病的病因鉴定，并且允许新治疗策略的发展和新药靶蛋白的鉴定。2．现有技术2．1细胞表型分子分析的现有技术基因表达的研究可以是RNA水平或蛋白质水平的。这两种水平基本上反映了重要的表型参数。利用二维凝胶的蛋白质测定(McFarrel法)已知有大约15年。利用这些测定法，能详细描述对数千种蛋白质层析位置的分析。很早之前，已经用数据处理方法处理或估计这些电泳图谱。原则上，该方法的有效性较高，然而，它在两方面逊色于基于RNA分析的现代基因表达方法。特别是，无法从少量细胞中检测具有调节重要性的蛋白质，这是由于所用方法的灵敏度太低的事实。实际上，与核酸不同，蛋白质不能扩增。另外，该方法极其复杂，不适于自动化，并且非常昂贵。相反，RNA分析具有相当多的优点，并且由于PCR的应用，其更加灵敏。尤其是，根据序列能立即鉴定出认为重要的每一RNA种。具有已知序列的个体RNA的超量表达或欠量表达通常可轻易检测；然而，在此处所述的申请中，这只在例外情况中才有效。“差示展示”法最多能对表达进行半定量研究。PCR扩增的表达产物通过凝胶电泳分离。由于凝胶电泳的分辨率，其有效性受到限制。另外，该方法对于常规诊断的应用来说不够灵敏和稳定(Liang，P．和Pardee，A．B．，科学(Science)257，967-971)。较高超量表达或欠量表达的基因常常通过减数(subtractive)技术鉴定。平板接种待检细胞或组织种的cDNA克隆。cDNA作为比较物与克隆杂交。利用该技术不能可靠地制备表达模式。美国“人类基因组计划”的一个活动是对表达基因的系统测序。由此获得的数据能用来建立表达芯片，这使得能在一次实验中研究一种细胞或组织类型的几乎全部表达序列。2．2癌症疾病分析的技术现状基因突变总是引发癌症疾病，即，细胞变性。这些突变的原因可能是外源影响，或是细胞内事件。在少数例外中，常常影响基因组较大区域的个体突变(易位、缺失)导致细胞变性；但在大多数情况中，涉及不同基因的一系列突变，并且只是其联合作用才引起恶性疾病。这些DNA水平上的结果也反映于RNA及蛋白质水平上。就此而言，非常可能发生增殖，因为在许多情况中显然一种RNA的量和类型影响其它几种RNA种的合成程度。这导致相应蛋白质合成率的改变，随后，又能引起去调节代谢，从而启动调节和反调节机制。结果是所述细胞的基因表达模式，其已经以非常特异(但基本上不可确定)的方式修改，特异性是对于某些癌、癌的阶段和癌的恶性程度。迄今为止，这种现象已经超出自然科学的研究领域。实际上，完全地检查基因表达或细胞的代谢是不可能的。芯片技术第一次提供了这种可能性(Schena，M．等人，科学270，467-470)。如果希望在分子水平上解决肿瘤早期诊断的诊断问题，今天，人们除了极少数例外地将面临难以克服的困难因为，对于大多数肿瘤，对分子事件即不同突变的了解只是片面的，研究人员不知道应在医学检查材料中寻找什么。这意味着利用聚合酶链反应的显著敏感性和特异性是绝对不可能的。例如某些肠道肿瘤、尤因肉瘤和某些形式的白血病，实际上每一种都被界定为单一的、精确描述的突变。在这些情况中，从数百万正常细胞中鉴定变性细胞是可能的。然而，甚至在这些似乎明确定义的肿瘤群中，存在行为的差异，以致必定得出以下结论其它未知的遗传参数(例如个体的遗传背景)起重要作用。除了其它常规诊断参数之外，免疫学肿瘤标记是有用的辅助参数，但它们目前只是起一定的作用。然而，它们能用于预先筛选可疑细胞的用途。组织学在变性组织的鉴定中起重要且不可缺少的作用，但在早期诊断中不精确。由于大多数肿瘤没有为了诊断目的在分子水平上充分表征，因此，通常不存在再分为阶段抑或根据危险程度再分的可能性。然而，这种再分是改进治疗的选择性、尤其是有效新药和基因治疗发展的绝对必要条件。2．3对高等生物细胞可能稳定状态的数量、类型和性质的研究的技术现状现时，有增多的迹象表明，复杂调节系统(一种极好的例子是细胞调节)当单独时能以有限数量的稳定状态存在，高于临界最低复杂性，低于(与任一给定成分连接的成分平均数的)临界最大连接性(Kauffman，S．A．，《秩序的起源》(Origins of Order)，OxfordUniversity Press，1993)。就此而言，术语状态应当理解为普遍现象选择的概念。关于作为生物调节系统的细胞，也能谈及分化状态或细胞型。尽管尚未证明这种联系-甚至尚未证明生物系统可能状态的限制-但实际含义应当是非常重要的。关于生物细胞的固定信息内容(事实上，这种恒定性基本上只存在于一个种群内)，如果只存在有限数量的稳定状态，那么变性细胞可能也只是处于这些状态之一或可能的状态之间的过渡态。此时，在分子基础上定义这些状态是不可能的。根据现有技术水平，几乎不可能实现个体状态与细胞行为之间的相关。然而，这种分析明确地有助于疾病的诊断和预后。甚至有可能在疾病细胞的可能状态和最适合的疗法之间建立相关性。此外，或许这种方法也能在治疗时间的选择中具有决定性的影响。例如，如果想发现肿瘤细胞处于可能状态之间的过渡态，则可以假定这种细胞群更可能受到治疗引起的选择压力，从而能更轻易地逃脱。在这种情况中，此过渡态的细胞群体具有大大增强的灵活性，并且可轻易地述到可能的稳定状态，其中选择压力将消除，因而治疗无效。能根据状态将细胞和细胞组分类的方法也将有利于认识、理解并可能解决这些问题。然而，根据现有技术水平，不可能确定是否只存在有限数量的细胞状态。从而不可能根据关于状态的抽象标准区别细胞组，并用某些细胞行为预测这些状态。2．4遗传性疾病今天，人类基因组的基因图谱包括2500个所谓的微卫星。这些工具用来通过连锁分析定位大量基因，通常是其缺陷引起遗传性疾病的基因，然后鉴定它们。这样从遗传学家法则的观点阐明由单个缺陷基因引起的常见遗传性疾病，多基因疾病也能用此方式理解。许多多基因疾病是很常见的，包括于所谓的广泛传播的疾病中。哮喘和糖尿病是其实例。也包括许多癌的类型。上述连锁分析策略的应用最初也得到巨大成功。在许多情况中，发现了重要多基因疾病如糖尿病、精神分裂症、动脉粥样硬化和肥胖症的大量致病基因。除了适当的分子生物学实验室技术的可用性之外，每本文档来自技高网...

【技术保护点】
组织和细胞型的表征、分类和鉴别方法，用于对组织和细胞群行为的预测，并用于对具有改变表达的基因的鉴定，其特征在于： 在基因组ＤＮＡ中，它从任一组织样品中获得，未受处理、受剪切或通过限制性内切核酸酶切割，将碱基胞嘧啶而不是５－甲基胞嘧啶经亚硫酸氢盐溶液处理以本来已知的方式转化为尿嘧啶， 利用极短寡核苷酸或简并寡核苷酸或互补于连接体寡核苷酸的寡核苷酸，扩增这样处理的基因组ＤＮＡ的部分，这些连接体寡核苷酸在亚硫酸氢盐处理之前已与切割的ＤＮＡ的末端连接，总体上，富含鸟嘌呤ＤＮＡ链上剩余胞嘧啶和／或得自扩增部分的富含胞嘧啶ＤＮＡ链上的鸟嘌呤的量通过杂交或聚合酶反应检测，该量应使得该分析所产生的、可自动适用于处理算法的数据，有可能得出关于所分析细胞物质的表型的结论。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A欧莱克，SS欧莱克，J沃尔特，
申请(专利权)人：EPI基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]