一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法技术

本发明专利技术提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域，包括以下步骤：将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体；将侵染的外植体置于共培养基上黑暗培养；共培养结束后，切除外植体2/3的子叶，仅保留外植体的子叶节区，再浸没于GUS染色液中染色、脱色；根据GUS组织化学染色部位和染色面积进行染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当GUS瞬时表达指数值位于区间(55.56～77.77]时，判定为敏感基因型。本发明专利技术提供的筛选方法可以准确地评价不同基因型黄瓜对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率难以区分不同基因型农杆菌敏感性的问题。

A screening method for Agrobacterium sensitive genotypes of cucumber root cancer

The present invention provides a method for screening of cucumber Agrobacterium sensitive genotypes, which belongs to the technical field of biotechnology breeding of vegetables, which comprises the following steps: Agrobacterium solid inoculation infect Cucumber Cotyledonary Nodes of explants containing GUS gene plant expression vector; the explants were infected in co culture medium dark; co culture after resection of cotyledon explants of 2/3, retaining only the explant of cotyledon node zone, and then immersed in GUS staining, staining, staining was carried out according to the classification of decolorization; GUS histochemical staining area to determine the location and expression of GUS, belonging to each number of instantaneous explant level, according to the formula I the calculated formula and the classification of GUS gene transient expression index, when the expression index in the interval of the instantaneous GUS (55.56 ~ 77.77], to determine the sensitive genotype. The screening method provided by this invention can accurately evaluate the sensitivity of different genotype cucumber to Agrobacterium infection, and solves the problem that traditional GUS transient expression rate is difficult to distinguish the sensitivity of different genotype Agrobacterium.

【技术实现步骤摘要】
一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法
本专利技术涉及蔬菜生物技术育种
，具体涉及一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法。
技术介绍
黄瓜是世界范围内重要的蔬菜作物，也是我国设施生产中重要的蔬菜作物之一，2013年我国设施黄瓜种植面积为1051万亩，仅次于番茄的1215万亩，居第二位(李天来.我国设施蔬菜科技与产业发展现状及趋势[J].中国农村科技,2016,05:75-77.)。由于栽培黄瓜自身遗传背景狭窄，抗性种质缺乏，以及与野生抗性种质资源存在远缘杂交不亲和现象，致使采用传统的杂交育种手段难以将抗病、抗虫的优异基因导入栽培种中(顾兴芳,张圣平,张思远,王长林.抗南方根结线虫黄瓜砧木的筛选[J].中国蔬菜,2006,02:4-8.)。早在上世纪八十年代末期，随着根癌农杆菌遗传转化体系的成熟应用，国外已经开始了黄瓜转基因研究。自Trulson等(1986)采用发根农杆菌感染黄瓜下胚轴诱导再生植株以来，(TrulsonAJ,SimpsonRB,ShahinEA.Transformationofcucumber(CucumissativusL.)plantswithAgrobacteriumrhizogenes[J].TheoreticalAppliedGenetics,1986,73(1):11-15.)黄瓜遗传转化体系不断完善，目前已经基本建立了农杆菌介导子叶或子叶节的遗传转化体系，主要用于基因功能验证。新型的CRISPR/cas9等基因编辑技术具有定向编辑且不引入外源基因等优势，为黄瓜等作物抗病、抗逆育种打开了新的思路。基因编辑技术依赖于高效的遗传转化系统，因此，建立高效规模化黄瓜遗传转化体系，将为基因编辑技术在黄瓜育种中的应用提供基础。黄瓜遗传转化主要采用农杆菌介导子叶或子叶节遗传转化途径，由于黄瓜遗传转化影响因素较多，特别是农杆菌介导法步骤繁琐，遗传转化效率在各基因型间差异较大(0.5％～23.0％)，限制了转基因技术在黄瓜种质遗传改良和基因功能分析方面的应用(WANGSL,KuSS,YEXG,HECF,KwonSY,ChoiPS.Currentstatusofgenetictransformationtechnologydevelopedincucumber(CucumissativusL.)[J].JournalofIntegrativeAgriculture,2015,14(3)：469-482.)。传统的GUS瞬时表达率为GUS染色阳性外植体数与侵染外植体数的比值。由于GUS染色阳性外植体之间存在巨大差异，若不进行详细分类描述，难以区分出不同黄瓜品种对农杆菌侵染的敏感性差异。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，准确地评价不同基因型黄瓜材料对农杆菌侵染的敏感性，解决了传统GUS瞬时表达率区分不出不同品种农杆菌敏感性的问题。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：0级无GUS蓝色；1级GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；2级子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；3级子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；4级蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mMK4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1～1.0mMK3[Fe(CN)6]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的TritonX-100，0.5～1.5mg·mL-1的X-Gluc。优选的，所述GUS染色液包括以下组分：38.5mmol·L-1磷酸钠缓冲液，0.5mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.5mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为20％的甲醇溶液，体积百分含量为1.0％的TritonX-100，1.0mg·mL-1的X-Gluc。优选的，所述步骤1)固态接种侵染的方法包括：将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌在固体YEB平板划线活化培养至肉眼可见明显菌斑，用灭菌棉棒蘸取活化的农杆菌菌体在黄瓜子叶节伤口区域轻轻涂抹2～3次。优选的，所述步骤2)中黑暗培养的条件包括：所述黑暗培养的温度为22-25℃，所述黑暗培养的时间为1～5d。优选的，所述步骤2)共培养基以MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：1～3mg·L-16-苄基氨基嘌呤、0.1～0.3mg·L-1脱落酸、150～250μmol·L-1乙酰丁香酮、质量体积百分含量为1～5％的蔗糖、质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述共培养基的pH值为5.0～6.0。优选的，所述步骤4)乙醇溶液中乙醇的体积百分含量为90～95％。优选的，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间[0.0,11.11]时，判定待测黄瓜基因型为高抗根癌农杆菌侵染基因型；当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(11.11,33.33]时，判定待测黄瓜基因型为抗根癌农杆菌侵染基因型；当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(33.33,55.55]时，判定待测黄瓜基因型为耐根癌农杆菌侵染基因型；当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(77.78～100]时，判定待测黄瓜基因型为根癌农杆菌侵染高感基因型。优选的，所述步骤1)黄瓜子叶节外植体的获取方法包括：将黄瓜种子消毒后置于萌发培养基上进行萌发培养4～5d，获得黄瓜无菌苗；在所述黄瓜无菌苗苗上，取含有2～3mm下胚轴的子叶，得到黄瓜子叶节外植体。优选的，所述萌发培养基以1/2MS培养基为基础培养基，以水为溶剂，包括以下组分：质量体积百分含量为1～3％的蔗糖和质量体积百分含量为0.5～1.2％的琼脂，所述萌发培养基的pH值为5.0～6.5。优选的，所述萌发培养的条件包括：所述培养的温度为20～30℃，所述培养在光暗交替的条件下进行，一个交替周期中先光培养14～18h再暗培养6～10h，所述光培养的光照强度为90～150μmol·m-2·s-1。本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：0级 无GUS蓝色；1级 GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；2级 子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；3级 子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；4级 蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；...

【技术特征摘要】
1.一种黄瓜根癌农杆菌敏感基因型的筛选方法，包括以下步骤：1)将含有GUS基因植物表达载体的根癌农杆菌固态接种侵染黄瓜子叶节外植体，得到侵染外植体；2)将所述步骤1)得到的侵染外植体置于共培养基上黑暗培养，得到黑暗培养后的外植体；3)对所述步骤2)得到的黑暗培养后的外植体进行处理，仅保留外植体的子叶节区，将处理后的外植体浸没于GUS染色液中染色10～12h，再置于乙醇溶液中脱色12～15h，得到除去叶绿素的外植体；4)根据步骤3)中除去叶绿素的外植体的GUS蓝色部位和显色面积进行GUS组织化学染色分级，确定归属每个GUS瞬时表达级别的外植体数目，根据式I所示公式和分级情况计算得到GUS基因瞬时表达指数，当所述GUS瞬时表达指数的范围值位于区间(55.55,77.77]时，判定待测黄瓜基因型为黄瓜根癌农杆菌敏感基因型；所述GUS组织化学染色分级分为5个GUS瞬时表达级别：0级无GUS蓝色；1级GUS蓝色的的组织或细胞部位呈点状分布，蓝色面积≤子叶节区面积的25％；2级子叶节区面积的50％≥蓝色面积>子叶节区面积的25％，染色部位位于不定芽再生部位之外；3级子叶节区面积的75％≥蓝色面积>子叶节区面积的50％，染色部位位于不定芽再生部位；4级蓝色面积>子叶节区面积的75％，染色部位位于不定芽再生部位，所述4级为GUS瞬时表达级别的最高级别；所述GUS染色液包括以下组分：35～40mM磷酸钠缓冲液，0.1～1.0mMK4[Fe(CN)6]·3H2O，0.1～1.0mMK3[Fe(CN)6]，体积百分含量为15～25％的甲醇溶液，体积百分含量为0.5～1.5％的TritonX-100，0.5～1.5mg·mL-1的X-Gluc。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述GUS染色液包括以下组分：38.5mmol·L-1磷酸钠缓冲液，0.5mmol·L-1K4[Fe(CN)6]·3H2O，0.5mmol·L-1K3[Fe(CN)6]，体积百分含量为20％的甲醇溶液，体积百分含量为1.0％的TritonX-100，1.0mg·mL-1的X-Gluc。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)固态接种侵染的方法包括：将含有GUS基因植物表达载体的根癌...

【专利技术属性】
技术研发人员：张功臣，张守才，李磊，秦玉红，王波，江志训，李磊，崔健，孙吉禄，王珍青，刘玲，
申请(专利权)人：青岛市农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：山东,37