恶性扩散癌发作的早期预测方法技术

一种用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后方法，包括通过施用选择性染色可疑的癌性和癌症前期组织部位的染料鉴别这类部位，然后通过分子基因分析确定这类部位的ＤＮＡ是否显示等位损失或者肿瘤抑制基因的突变。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后(prognostic)方法。
技术介绍
通过基因分析鉴定癌症前期组织所有的瘤确信源自业已经受基因改变的细胞，继之以克隆扩展(clonal expansion)。这些基因改变包括原癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活。鉴定伴随病理学发展的特异基因变化允许描述许多肿瘤的分子发育模型，包括口腔癌。这些发展模型提供辅助诊断和检测人肿瘤的分子标记。分子分析已经革新了查看原发人肿瘤中特异基因变化的能力。强大的基于PCR的技术允许使用常规制备的植入石蜡的组织样品，以用于DNA提取和随后的基因分析。可以扩增从这些样品提取的DNA以揭示各种基因改变，包括等位损失。这类等位损失(染色体缺失)是包含于损失区内的关键肿瘤抑制基因失活的标记。成熟肿瘤中，肿瘤抑制基因需要两步失活过程，这里必需敲除双亲等位基因以便肿瘤发育。通常地，一个等位基因的点突变继之以第二等位基因的缺失和肿瘤抑制功能完全丧失。这些由微卫星分析鉴别的等位损失缺失代表肿瘤抑制基因失活的普通第二失活步骤。实际上，等位损失(或缺失)可通过采用能够区分正常DNA中母源和父源等位基因的高度多态标记测定。然后这种样品(pattern)可以与肿瘤DNA比较，这里重组或缺失表示为母源或父源等位基因的损失(也称为LOH杂合性的损失)。最近，这种作图过程已经随着高度多态并位于整个人基因组中的微卫星标记(小DNA重复单位)的到来而革新。例如，人们可以测试在两条染色体臂上的关键肿瘤抑制基因部位。该区的一个位于染色体臂9p并含有称为p16(MTS-1或CDKN2)的关键肿瘤抑制基因。这种关键的细胞周期抑制剂通过大多数原发癌中的点突变、缺失和甲基化失活。在染色体区3p21可以进行第二分析，其在与吸烟有关肿瘤的最频繁缺失区中。尽管许多基因已经从3p区分离，在原发肿瘤或细胞系中没有候选基因经常地失活。重要地，9p和3p损失都是在恶性扩散癌发展中鉴别的最早的基因变化。具有头和颈癌的病人常常伴有气消化道的第二原发肿瘤。头和颈癌的基本的基因研究显示口腔中单转化细胞可以遍及粘膜，引起大面积与克隆有关和转化(clonally related and transformed)细胞。这里有进一步的证据，当在一个病人中产生两种损害时，它们通常在起源上是克隆的。例如，具有头和颈癌的病人通常具有大片的可以通过简单的活组织检查直接化验的异常细胞。参见，例如，Califano等，Genetic Progression Model for Headand Neck Cancer.Cancer Research 56(11)2488-2493(1996)；Sidransky，Nucleic Acid-based Methods for detection of Cancer.Science 278(5340)1045-058(1997)；Rosin等，Use of AllelicLoss to Predict Malignant Risk for Low-grade Oral EpithelialDysplasia，Clinical Cancer Research 6357362(2000)。于是，已知最终发育成恶性扩散癌的的早期预后可以通过来自可疑部位组织的基因分析实现，提供简单的临床方案是非常希望的，这类方案在其它的可视迹象开始之前很久，鉴别这类可疑部位的位置。现有领域Mashberg方案鉴别和描述上皮组织上可疑部位的体内诊断筛选试验是已知的。这种筛选试验，采用甲苯胺蓝O(TBO)染料以选择性地染色癌和癌症前期组织，一般描述在Mashberg的美国专利4321251和Tucci等的美国专利5372801中。最近研发了试剂盒，它使得临床医师快速和容易地进行试验成为可能，作为其它常规牙科或医学检查的一部分，从而在病人是无症状时或者当发育异常损害太小以致在普通目视检查中可能遗漏时，鉴别和/或描述可疑部位。一旦通过Mashberg方案鉴别出可疑的发育异常损害，采集合格(regular)的活组织检查样品并且进行常规的组织学检查，以确定损害是恶性的还是癌症前期的。进行该试验的试剂盒，含有适当数量和浓度的预先混合的染料和漂洗溶液，由Zila有限公司许可，并且在加拿大、澳大利亚和欧洲商业上以OraTestM商标销售。以后确定其它的阳离子染料同样有效(参见，例如Pomerantz的美国专利5882672)，这类染料的选择性标记作用归因于它们通过癌性和癌症前期细胞线粒体的摄取和保留。实施例1临床试验方案本实施例举例说明Mashberg方案的常规实践。临床试验溶液的制备TBO(例如，按照本专利技术人美国专利6086852的实施例1制备)，覆盆子增香剂(IFF覆盆子IC563457)，三水醋酸钠缓冲剂和H2O2(30％USP)防腐剂(参见美国专利5372801)，溶于纯水(USP)，冰醋酸和SD18乙醇，产生TBO试验溶液，组成如表A所示表A组分重量％TBO 1.00香料 .20缓冲剂 2.45防腐剂 .41醋酸4.61乙醇7.48水83.85100.00制备在纯水、苯甲酸钠防腐剂和覆盆子香料中1wt％醋酸的预漂洗和后漂洗试验溶液。临床方案给病人披上围布以保护衣物。估计会有咳出物，故给病人提供一个10-oz.的杯子，其可倾倒于感染性废物容器或者其内容物可直接倒进洗涤盆下水道中央，以免污染洗涤盆。将环境表面或可能被污染的物品罩起或从试验区移走。进行口腔癌的目视检查，不使用任何会使软组织产生划痕或切口的器械。在软组织和牙齿的预染色表面作出标记。让病人用约15ml预漂洗溶液漱口约20秒然后咳出，吐去过多的唾液使口腔环境恒定。然后再用预漂洗溶液重复此步骤。然后，病人用水漂洗和漱口20秒，咳出。然后，病人用30ml TBO试验溶液漂洗和漱口1分钟，咳出。然后，病人用15ml后漂洗溶液漂洗20秒，咳出。然后重复这一步。病人接着用水漂洗和漱口20秒，咳出。然后重复这一步。接着对口腔进行观察，必要时使用适宜的软组织检测技术，包括退缩(retraction)、平衡光照和放大(well-balanced lightingand magnification)。记录染上蓝色的可疑损害的位置、大小、形态、颜色和表面特征。为了减少假阳性，请病人在10-14天后返回重复上述方案。在此期间让时间去治愈任何第一次检查时存在的溃疡性或创伤性损害或刺激性病源。第二次检查之后，在第一次检查确定的可疑区域出现的阳性染色被认为是癌或癌症前期组织的指示(indication)，应进行活组织检查来确认这一结论。早期无核红细胞(erythroplastic)损害染上蓝色，经常为点彩(stippled)或片状(patchy)图样。但是，舌背上的不规则乳头缝被染上蓝色是正常的，不表示阳性。保持蓝色但不认为是阳性的其它区域包括每颗牙齿的牙斑、牙龈边缘，从舌背保留的染色移走的染料在软腭上形成的渗出染色，以及容易确诊的溃疡性损害。在任何情形下，当某一损害高度可疑，但用本检测不呈阳性染色时，进行活组织检查仍是必要的。“假阳性”直至现在才明白Mashberg方案可提供“假阳性”指示，即，在后来的常规组织学检查中并不确认癌或癌症前期本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于最终发育成恶性扩散癌的早期预测的预后方法，所述的方法包括：（ａ）向组织施用被瘤和肿瘤前细胞线粒体选择性保留的染色染料；（ｂ）通过目视检查所述组织寻找染色组织部位，鉴别所述组织的克隆片；（ｃ）切除所述克隆片部位的组织； （ｄ）确定从所述切除组织提取的ＤＮＡ是否显示等位损失或者肿瘤抑制基因的突变。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：道格拉斯D伯克特，
申请(专利权)人：日拉公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]