一种鼻咽癌相关基因ＮＧＸ６表达产物的获取及抗体的制备。本发明专利技术采用多聚酶链式反应方法克隆ＮＧＸ６基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入ＪＭ１０９的大肠杆菌中，ＩＰＴＧ诱导其在大肠杆菌中的表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定，用ＧＳＴ融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，本发明专利技术据原核表达载体ｐＥＧＸ－３Ｘ的ＧＳＴ阅读框架设计引物，使ＮＧＸ６基因的编码区阅读框与ＧＳＴ的阅读框架一致。ＮＧＸ６是鼻咽癌发生和发展的重要的相关基因之一；它的表达产物蛋白质作用于鼻咽癌细胞，具有基因治疗意义；抗体可用于鼻咽癌诊断。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利说明鼻咽癌相关基因NGX6表达产物的获取及抗体的制备 本专利技术涉及鼻咽癌相关基因NGX6表达产物的获取及抗体的制备，属于基因工程领域。鼻咽癌是东南亚和我国南方各省常见的恶性肿瘤，发病率居世界首位，严重威胁人民的生命安全。目前对于鼻咽癌的早期诊断尚无有效的方法，患者一旦发现多已是中晚期，因而急待开发用于鼻咽癌早期诊断的新型手段。经过研究发现，NGX6与鼻咽癌的发生发展有一定的关联，本专利技术采用多聚酶链式反应(PCR)方法克隆NGX6基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入JM109的大肠杆菌中，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，Western blot鉴定，用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白。用HPLC大量分离与纯化蛋白质，并进一步制备兔多抗及小鼠单抗。在大规模的正常与患病人群中通过抗体检测NGX6的表达水平，建立检测标准。具体如下据原核表达载体pEGX-3X的GST阅读框架设计引物，使NGX6基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致。以含NGX6基因的质粒为模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol进行扩增，回收PCR产物条带。用SmalI酶切PCR回收产物及pEGX-3X载体，产生匹配的粘末端。小胶回收试剂回收线性的4.9kb的载体，NGX6编码区片段。将pEGX-3X载体与NGX6基因连接，构建成符合阅读框的GST-NGX6融合基因。用含融合基因的pEGX-3X质粒转化大肠杆菌JM109，小量制备质粒DNA，SalI和NotI酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒DNA纯化后用DNA自动测序仪测序。单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培养液中，于37℃过夜培养，将400μl过夜培养物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培养7h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，培养2.5h，转移至50ml离心管中。室温12000×g离心10min，去尽上清，置于冰上，重悬于预冷的600μl的PBS中。加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNase I，用液氮和温水介导的反复冻融法破膜，11000rp离心10min，收集上清。重悬GST MicroSpin纯化柱中的树脂，打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，弃液体，盖上底盖，柱中加入600μl的细菌裂解液。盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5～10min后打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗涤2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脱液，盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5-10min。735×g离心1min收集流出液。诱导后的菌液超声破碎裂解后，SDS-PAGE电泳，KCl染色后，切下融合蛋白条带，反复冻融，加入等体积的福氏完全佐剂混匀，乳化后备用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；两周后，注射抗原，采取背部多点注射；一周后加强一次，重复2-3次后采血。用环状沉淀实验确定其效价，当效价达到要求后，即可处死动物，收集血清。单抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，大量培养，可收集抗体，也可接种小鼠后，收集其血清或腹水。收集正常与癌标本多例，通过western blot和FISH检测NGX6的表达水平，确定NGX6在正常与异常组织中的表达差异，建立诊断标准。NGX6是鼻咽癌发生和发展的重要的相关基因之一；它的表达产物蛋白质作用于鼻咽癌细胞，具有基因治疗意义；抗体可用于鼻咽癌诊断。附图说明图1融合蛋白的诱导与表达。图2融合蛋白的纯化。图3琼脂双向扩散实验测定抗NGX6血清的效价和纯度。1.(1)据原核表达载体pEGX-3X的GST阅读框架设计引物，使NGX6基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致构建成符合阅读框的GST-NGX6融合基因。用含融合基因的pEGX-3X质粒转化大肠杆菌JM109，鉴定含插入片段的阳性克隆质粒(2)单个阳性菌落接种入含氨卞青霉素(100μg/ml)的2ml LB培养液中，37℃，过夜培养。将400μl过夜培养物分别接种到40ml含氨卞青霉素(100μg/ml)的LB培基中，于37℃培养7h，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃，培养2.5h，转移至50ml离心管中。室温12000×g离心10min，去尽上清，置于冰上，重悬于预冷的600μl的PBS中。加入终浓度为100μg/ml的溶菌酶、10μg/ml DNase I，用液氮和温水介导的反复冻融法破膜，11000rp离心10min，收集上清。(3)重悬GST MicroSpin纯化柱中的树脂，打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，弃液体，盖上底盖，柱中加入600μl的细菌裂解液。盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5-10min后打开盖及底盖，置于一干净的1.5ml的离心管中，735×g离心1min，再用400μl PBS用相同的方法洗涤2次。柱中加入200μl的谷胱苷肽洗脱液，盖紧上盖，轻轻混匀，置于室温5-10min。735×g离心1min收集流出液。(4)诱导后的菌液超声破碎裂解后，SDS-PAGE电泳，KCl染色后，切下融合蛋白条带，反复冻融，加入等体积的福氏完全佐剂混匀，乳化后备用。多抗的免疫程序兔右足后趾注射30mg卡介苗；两周后，注射抗原，采取背部多点注射；一周后加强一次，重复2-3次后采血。用环状沉淀实验确定其效价，当效价达到要求后，即可处死动物，收集血清。单抗的免疫程序免疫小鼠后收集腹腔巨噬细胞及小鼠的脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，筛选阳性克隆，大量培养，可收集抗体，也可接种小鼠后，收集其血清或腹水。权利要求1.一种鼻咽癌相关基因NGX6表达产物的获取，采用多聚酶链式反应方法克隆NGX6基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入JM109的大肠杆菌中，IPTG诱导其在大肠杆菌中的表达，SDS-PAGE电泳，Western blot鉴定，用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，本专利技术据原核表达载体pEGX-3X的GST阅读框架设计引物，使NGX6基因的编码区阅读框与GST的阅读框架一致；其特征在于以含NGX6基因的质粒为模板(0.1μg)，加入上述引物各10pmol进行扩增，回收PCR产物条带；用SmalI酶切PCR回收产物及pEGX-3X载体，产生匹配的粘末端；小胶回收试剂回收线性的4.9kb的载体，NGX6编码区片段；将pEGX-3X载体与NGX6基因连接，构建成符合阅读框的GST-NGX6融合基因；用含融合基因的pEGX-3X质粒转化大肠杆菌JM109，小量制备质粒DNA，SalI和NotI酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒DNA纯化后用DNA自动测序仪测序。2.根据权利要求1所述NGX6表达产物的多抗体的制备方法，其特征在于用HPLC大量分离与纯化蛋白质，兔右足后趾注射30mg卡介苗；两周后，注射抗原，采取背部多点注射；一周后加强一次，重复2-3次后采血。用环状沉淀实验确定其效价，当效价达到要求后，收集血清。3.根据本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鼻咽癌相关基因ＮＧＸ６表达产物的获取，采用多聚酶链式反应方法克隆ＮＧＸ６基因蛋白编码序列，构建该基因的融合表达质粒，导入ＪＭ１０９的大肠杆菌中，ＩＰＴＧ诱导其在大肠杆菌中的表达，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定，用ＧＳＴ融合蛋白纯化试剂盒纯化融合蛋白，本专利技术据原核表达载体ｐＥＧＸ－３Ｘ的ＧＳＴ阅读框架设计引物，使ＮＧＸ６基因的编码区阅读框与ＧＳＴ的阅读框架一致；其特征在于：以含ＮＧＸ６基因的质粒为模板（０．１μｇ），加入上述引物各１０ｐｍｏｌ进行扩增，回收ＰＣＲ产物条带；用ＳｍａｌⅠ酶切ＰＣＲ回收产物及ｐＥＧＸ－３Ｘ载体，产生匹配的粘末端；小胶回收试剂回收线性的４．９ｋｂ的载体，ＮＧＸ６编码区片段；将ｐＥＧＸ－３Ｘ载体与ＮＧＸ６基因连接，构建成符合阅读框的ＧＳＴ－ＮＧＸ６融合基因；用含融合基因的ｐＥＧＸ－３Ｘ质粒转化大肠杆菌ＪＭ１０９，小量制备质粒ＤＮＡ，ＳａｌⅠ和ＮｏｔⅠ酶切鉴定是否含插入片段，含插入片段的阳性克隆质粒ＤＮＡ纯化后用ＤＮＡ自动测序仪测序。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：李桂源，李江，张秋红，谭琛，黄宇琛，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]
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