测定核酸碱基序列的方法技术

本发明专利技术涉及一种测定核酸的碱基序列的方法，其特征在于包括下述步骤：在分别具有一个标志序列的至少两种引物、一种模板核酸特异性引物和ＤＮＡ聚合酶存在下，扩增所述模板核酸，其中所述具有标志序列的引物分别在其５’末端一侧具有所述标志序列，而在３’末端一侧具有一个由三个或三个以上核苷酸构成的特定碱基序列；并且对在上述步骤中获得的扩增片段进行直接测序。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种可用于基因工程领域的测定核酸的核苷酸序列的方法。
技术介绍
目前，分析核酸的核苷酸序列的主流方法是链终止法，其中通过采用平板型或毛细管型凝胶电泳来进行分析。在该方法中一次可以分析的核苷酸序列的长度由于所使用的聚合酶和电泳设备的改进而得到增加。然而，可以分析的长度通常仅约500个碱基对，最多1000个碱基对或稍少。因此，为了测定已经克隆到传统载体(质粒、噬菌体、粘粒等)的长于数千个碱基对的DNA片段的核苷酸序列，人们需要使用引物步查法、亚克隆法和缺失克隆构建法之一或其组合。例如，如果使用引物步查法测定已经克隆到质粒载体中的长度为5000个碱基对的DNA片段的核苷酸序列，则首先使用具有所述载体上的核苷酸序列的引物从已克隆DNA片段的一个末端测定核苷酸序列。然后根据新获得的核苷酸序列信息设计并合成另一种引物，以测定先前测定的核苷酸序列区域之外的一个区域的核苷酸序列。通过重复上述步骤数次，可以测定已克隆片段的完整的核苷酸序列。然而，由于引物步查法要求在核苷酸序列测定的每个步骤设计并合成一种引物，因此需要许多时间和费用。如果用亚克隆法分析这样一种DNA片段的核苷酸序列，则首先用不同的限制性酶消化质粒DNA，以便根据所述消化所产生的DNA片段的长度制备已克隆DNA片段的限制性图谱。将通过用根据限制性图谱选择的限制性酶消化所获得的DNA片段，亚克隆到噬菌体或质粒载体中。然后，用具有所述载体上的序列的一种引物测定核苷酸序列。由于亚克隆法需要复杂的步骤，包括制备限制性图谱和后续的亚克隆，所以需要很大的工作量和许多时间。另外，适合于亚克隆的限制性酶识别位点需要一致地分布在原始已克隆DNA片段上，以便有效地按照该方法测定所述DNA片段的核苷酸序列。缺失克隆构建法是Yanisch-Perron等开发的一种核苷酸序列测定法，如Gene，33103-119(1985)中所述，在该方法中，通过从作为基点的已克隆片段一端连续缩短该片段，制备一系列克隆。按照该方法，与引物步查法和亚克隆法相关的问题得到部分解决。具体地说，缺失克隆构建法不需要在核苷酸序列测定的每个步骤设计并合成引物(这是按照引物步查法所需要的)或者制备限制性图谱并且根据限制性图谱进行亚克隆(这是按照亚克隆法所需要的)。然而，缺失克隆构建法需要相当多的基因工程技术，因为为了按照该方法制备具有连续缩短的DNA片段的一系列克隆，需要用两种限制性酶即外切核酸酶III、外切核酸酶VII、Klenow片段DNA聚合酶和DNA连接酶按照这种顺序，在适合于相应酶的条件顺序处理具有已克隆DNA片段的质粒。此外，在最终的顺序处理之前，还必需通过进行初步实验测定已克隆DNA片段对外切核酸酶III的反应性(缺失的倾向)，因为反应性随已克隆DNA片段的核苷酸序列而变化。分析通过PCR随机扩增片段的核苷酸序列的方法包括Telenius等的简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)法(Genomics，13718-725(1992))和Wong等的标志随机六聚体扩增(TRHA)法(Nucleic Acids Research，24(19)3778-3783(1996))。在每种方法中，都使用含有随机序列的多种引物的混合物进行PCR，分离多重扩增的序列梯条带并逐个纯化，然后进行测序。因此，这些方法的步骤是复杂的。如上所述，目前用于分析核酸的核苷酸序列的所有方法都有问题。因此，需要一种快速低成本的分析核酸的核苷酸序列的方法，以分析基因组。专利技术目的本专利技术的主要目的是提供一种测定核酸的核苷酸序列的方法，其中无需复杂的步骤而制备一系列长度从模板核酸上的一个基点连续缩短的扩增DNA片段，并且分析所述DNA片段的核苷酸序列。专利技术概要作为深入研究的结果，本专利技术人已经发现，通过组合用一种模板特异性引物和从具有已确定核苷酸序列的多种引物构成的引物库中选择的一种引物进行PCR，可以制备一系列从模板DNA上的一个基点改变长度的扩增DNA片段。本专利技术人已经证明，通过测定所述系列的扩增DNA片段中各个DNA片段的核苷酸序列，可以分析原始DNA片段的完整的核苷酸序列，因而本专利技术得以完成。本专利技术的第一方面涉及一种测定核酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括(1)在分别具有一个标志序列的至少两种引物的每一种引物、一种模板核酸特异性引物和DNA聚合酶存在下，扩增模板核酸，其中具有标志序列的引物在5’端一侧具有标志序列，而在3’端一侧具有一个三个或三个以上核苷酸的已确定的核苷酸序列；并且(2)对在上述步骤(1)中扩增的片段进行直接测序。按照第一方面，可以使用具有通式所示结构的引物作为具有标志序列的引物通式5’-标志序列-Sa-3’其中“S”代表选自G、A、T和C的一种核苷酸或者两种或两种以上核苷酸的混合物，而“a”代表3或3以上的整数，条件是“Sa”中的至少三个S代表选自G、A、T和C的一种核苷酸。按照第一方面，可以使用选自表1-5中所列引物的一种引物作为具有标志序列的引物。按照第一方面，模板核酸的扩增例如使用聚合酶链式反应(PCR)进行。可以优选使用pol I型DNA聚合酶、α型DNA聚合酶或非pol I非α型DNA聚合酶或者DNA聚合酶的混合物作为PCR中的DNA聚合酶，并且所述DNA聚合酶可以选自Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、Ex-Taq DNA聚合酶、LA-Taq DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶和KOD dash DNA聚合酶。第一方面的方法还可以包括选择一种产生基本为单一条带的PCR扩增片段的反应。该方法还可以包括选择一个基本为单一条带的PCR扩增片段。第一方面可以直接在样品上进行，或者在从样品制备模板核酸后进行。可以优选使用质粒、噬菌体、粘粒、BAC或YAC文库、或者基因组DNA或cDNA形式的模板核酸。本专利技术的第二方面涉及一种用于第一方面的测定核酸的核苷酸序列的方法的引物库，所述引物库含有至少两种引物，每种引物都在5’端一侧具有一个标志序列，而在3’端一侧具有一个三个或三个以上核苷酸的已确定的核苷酸序列。可以优选使用具有通式所示结构的引物作为第二方面的引物库中具有标志序列的引物通式5’-标志序列-Sa-3’其中“S”代表选自G、A、T和C的一种核苷酸或者两种或两种以上核苷酸的混合物，而“a”代表3或3以上的整数，条件是“Sa”中的至少三个S代表选自G、A、T和C的一种核苷酸。按照第二方面，引物中的标志序列可以含有测序用引物的一种序列。本专利技术的第三方面涉及一种用于测定核酸的核苷酸序列的组合物，所述组合物含有第二方面的引物库。第三方面的组合物还可以含有一种DNA聚合酶。可以使用pol I型DNA聚合酶、α型DNA聚合酶或非pol I非α型DNA聚合酶、或者DNA聚合酶的混合物作为所述DNA聚合酶。例如可以优选使用TaqDNA聚合酶、Ex-Taq DNA聚合酶、LA-Taq DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶或KOD dash DNA聚合酶。本专利技术的第四方面涉及一种用于第一方面的测定核酸的核苷酸序列的方法的试剂盒，所述试剂盒含有第二方面的引物库。第四方面的试剂盒还可以含有DNA聚合酶和供所述DNA聚合酶用的缓本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定核酸的核苷酸序列的方法，所述方法包括： （１）在分别具有一个标志序列的至少两种引物的每一种引物、一种模板核酸特异性引物和ＤＮＡ聚合酶存在下，扩增所述模板核酸，其中所述具有标志序列的引物在５’端一侧具有所述标志序列，而在３’端一侧具有一个三个或三个以上核苷酸的已确定的核苷酸序列；并且 （２）对在以上步骤（１）中扩增的片段进行直接测序。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：上森隆司，山下裕兄，外园成和，佐藤好美，向井博之，浅田起代藏，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]