扩增的核酸及其固定化制品制造技术

利用嵌合寡核苷酸引物通过核酸扩增反应而大量提供的核酸，以含有经修饰以供将所述核酸固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的状态构建，然后高效地固定化到固相上，从而得到高质量的固定化核酸制品。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可用于基因分析领域的高灵敏度DNA芯片。
技术介绍
已经开发了将核酸固定于其上的基质(例如DNA芯片)，作为用于快速促进基因功能分析计划的工具。它已经广泛地用于分析所有酵母基因以及培养细胞和组织中的基因的表达。用于制备DNA芯片(或DNA阵列)的已知方法包括例如其中在芯片固相上的预定区内合成单链DNA的方法、以及其中将预先制备的单链或双链DNA点样在芯片固相上的预定区内的方法。依照前一方法制备的DNA芯片的实例为美国专利第5,445,934、5,744,305和5,700,637号中描述的高密度寡核苷酸阵列。依照后一方面制备的DNA芯片的实例为美国专利5,807,522号和WO 98/18961中描述的点样阵列。可以采用这种方法，通过将DNA点样在芯片固相上的预定区内，制备DNA芯片。例如，用针尖将DNA片段物理点样在固相基质上，例如在已经经过特殊处理，例如多聚L-赖氨酸包被或硅烷化的玻片上。在这种情况下，所述DNA片段静电结合到所述固相基质上。因此，结合效率可能随包被到固相基质上的条件而改变。另一方面，制备上述高密度寡核苷酸阵列，需要高密度固相合成用的大规模装置。此外，由于其合成产量，依照该方法难以合成长的核苷酸链。在这两种制备方法中，必需大量合成待固定化的核酸。除短链DNA例如寡核苷酸的合成之外的大多数核酸扩增方法，用DNA聚合酶通过酶促方法来进行。所述方法的一个例子是美国专利第4,683,195、4,683,202和4,800,159号中详述的聚合酶链式反应(PCR)法。另一个例子是Trends in Biotechnology，10146-152(1992)中描述的逆转录-PCR(RT-PCR)法，它是PCR和逆转录酶反应的组合。上述方法的开发，使得能够从DNA或RNA扩增感兴趣的区。上述DNA合成法例如用由三个步骤组成的反应来进行。这三个步骤是使双链DNA解链(变性)为单链DNA的步骤、使引物退火至单链DNA上的步骤和从所述引物合成(延伸)互补链以便扩增感兴趣的DNA区的步骤。或者，它们用名为“穿梭PCR”的反应(Recent advancesin PCR methodology)Tanpakushitsu Kakusan Kouso，Bessatsu，(Protein，Nucleic Acid and Enzyme，Supplement)，41(5)425-428(1996))来进行，其中所述三个步骤的两个步骤，即引物退火步骤和延伸步骤在同一温度下进行。另一方面，可以使用1989年6月14日公开的EP 320,308中描述的连接酶链式反应(LCR)法、或者在PCR Protocols，Academic Press，Inc.，1990，pp.245-252中描述的基于转录的扩增系统(TAS)法。上述四种方法需要在高温和低温下重复反应数次，以便再生用于下一扩增循环的单链靶分子。所述反应系统应该采用不连续相或循环进行，因为如上所述，该反应受温度限制。因此，所述方法需要使用可以在规定时间内精确调节宽范围温度的昂贵的热循环仪。此外，所述反应需要时间以将温度调至两个或三个预定温度。时间的损失与循环数成比例增加。已经开发了可以等温进行的核酸扩增法，以解决所述问题。其实例包括在日本专利2,076,096和2,087,487号中描述的链置换扩增(SDA)法、自身支持性序列扩增(3SR)法、日本专利2,650,159号中描述的基于核酸序列的扩增(NASBA)法、转录介导的扩增(TMA)法、日本专利2,710,159号中描述的Qβ复制酶法和美国专利第5,824,517号、WO99/09211、WO 95/25180和WO 99/49081中描述的各种改进SDA法。寡核苷酸的等温酶促合成法描述于美国专利第5,916,777号中。在这些等温核酸扩增或寡核苷酸合成方法的反应中，从引物延伸和/或引物退火至单链延伸产物(或退火至原始靶序列上)、然后从引物延伸，在恒定温度下保温的反应混合物中平行进行。在等温核酸扩增法中，SDA法是最终扩增DNA的系统的例子。SDA法是用于通过用DNA聚合酶和限制性内切核酸酶置换双链而扩增样品中靶核酸序列(及其互补链)的方法。所述方法需要四种扩增用引物，其中两种应该设计为含有限制性内切核酸酶的识别位点。所述方法需要用经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸作为大量合成DNA的底物。所述经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸的实例是(α-S)脱氧核糖核苷酸三磷酸，其中α位磷酸基团的氧原子被硫原子(S)所取代。如果该反应常规进行例如用于遗传检验，与使用所述经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸相关的操作费用的问题则变得严重。此外，在所述方法中，所述经修饰核苷酸例如(α-S)脱氧核糖核苷酸掺入到扩增的DNA片段中，当进行限制性酶片段长度多态(RFLP)分析时，可能消除了限制性酶对DNA扩增片段的可切割性。美国专利第5,824,517号中描述的改良SDA法，是一种使用由RNA和DNA组成并且其基本结构为DNA至少位于3’末端的嵌合引物的DNA扩增法。WO 99/09211中描述的改良SDA法需要使用产生3’突出端的限制性酶。WO 95/25180中描述的改良SDA法需要使用至少两对引物。WO 99/49081中描述的改良SDA法需要使用至少两对引物和至少一种经修饰的脱氧核糖核苷酸三磷酸。另一方面，在美国专利第5,916,777号中描述的寡核苷酸合成方法包括用在3’末端具有核糖核苷酸的引物合成DNA，用所述引物完成反应，用内切核酸酶在引物延伸的链中所述引物和延伸链之间引入切口以便将其分开，消化模板，并且回收引物以便再使用。在所述方法中，需要从反应系统中分离引物，然后让其再次退火至模板上，以便再利用所述引物。另外，WO 00/28082中描述的LAMP法需要四种扩增引物，并且用该方法扩增的产物是大小变化的DNA，其中扩增的靶区被重复。如上所述，依照常规核酸扩增法，难以大量生产和供应供具有固定化核酸的基质用的核酸。可以采用WO 00/56877中描述的ICAN法，来大量生产核酸以及低成本地生产具有固定化核酸的材料。然而，所述方法有如下问题。在依照该方法扩增的片段中，可以含有核糖核苷酸。如果将所述扩增片段固定到固相上，则所述固定化核酸在某些后处理时可能被降解和释放。专利技术目的本专利技术的主要目的是制备核酸，所述核酸利用嵌合寡核苷酸引物通过核酸扩增反应来大量供应，使得所述核酸含有脱氧核糖核苷酸，所述脱氧核糖核苷酸经修饰以便固定到固相上和通过将所述核酸高效地固定到固相上而获得具有高质量固定化核酸的材料。专利技术概述由于深入的研究，本专利技术人构建了一种利用等温嵌合引物起始的核酸扩增(ICAN)法生产用于制备具有固定化核酸的材料的核酸的方法。所述ICAN法是一种核酸扩增法，其中在其中核糖核苷酸位于3’末端或3’端一侧的嵌合寡核苷酸引物、内切核糖核酸酶和DNA聚合酶存在下，扩增DNA中的目标区。此外，本专利技术人通过用引物或经修饰以供将扩增核酸固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸进行所述ICAN法，可以获得含有经修饰的脱氧核糖核苷酸的ICAN反应产物。本专利技术人已经构建了一种通过将如此获得的含有经修饰的脱氧核糖核苷酸的ICAN反应产物固本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸的扩增核酸，所述扩增核酸通过包括下述步骤的核酸扩增法获得：（ａ）通过将作为模板的核酸、脱氧核糖核苷酸三磷酸、具有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶、至少一种引物和ＲＮＡ酶Ｈ混合，制备反应混合物，其 中所述引物是一种与所述作为模板的核酸的的核苷酸序列基本互补并且含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合寡核苷酸引物，所述核糖核苷酸位于所述引物的３’末端或者位于３’端一侧，其中所述脱氧核糖核苷酸三磷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸三磷酸和／或所述脱氧核糖核苷酸的一部分是经修饰以供固定到固相上的脱氧核糖核苷酸；和（ｂ）将所述反应混合物保温足够的时间，以产生反应产物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：峰野纯一，武田理，六正知，上森隆司，外园成和，向井博之，山下周作，佐川裕章，浅田起代藏，加藤郁之进，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]