探测胞嘧啶甲基化模式的高灵敏度方法技术

本发明专利技术涉及一种在ＤＮＡ样品中探测胞嘧啶甲基化的方法，其中进行了下面的步骤：将包含所研究的ＤＮＡ和背景ＤＮＡ的基因组ＤＮＡ样品以这样一种方式进行化学处理，从而使得所有非甲基化的胞嘧啶碱基都转变为尿嘧啶，而５－甲基胞嘧啶碱基保持不变；用至少２个引物寡核苷酸和一个聚合酶对经化学处理的ＤＮＡ样品进行扩增，其中所研究的ＤＮＡ相对于背景ＤＮＡ是优选被作为模板的；并且分析扩增产物，并从扩增产物的存在性和／或从对其它的位置的分析中推断所研究的ＤＮＡ中的甲基化状态。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在DNA样品中探测胞嘧啶甲基化的方法。近几年中在分子生物学中由于方法的发展而充分研究的观察水平是基因本身，即这些基因至RNA的翻译和由此产生的蛋白质。在个体发育过程中，哪些基因何时开启及某些细胞和组织中某些基因激活和抑制如何得到控制，与基因或基因组甲基化的程度和特性相关。致病的状态也是以单个基因或基因组的改变了的甲基化模式表达的。5-甲基胞嘧啶是真核细胞DNA中最经常进行共价修饰的碱基。例如，它在转录调节中、在遗传印记中和在肿瘤发生中起作用。5-甲基胞嘧啶作为遗传信息成分的鉴定因而具有相当的重要性。然而5-甲基胞嘧啶位置不能通过测序来鉴定，这是因为5-甲基胞嘧啶与胞嘧啶具有相同的碱基配对性质。此外，在PCR扩增的情况下，由5-甲基胞嘧啶携带的外遗传信息完全丧失了。其后研究DNA的5-甲基胞嘧啶最经常应用的相对新的方法是基于亚硫酸氢盐与胞嘧啶的特定反应的，胞嘧啶在随后的碱水解之后转变为尿嘧啶，尿嘧啶在碱基配对性质上相应于胸腺嘧啶。相反地，5-甲基胞嘧啶在这些条件下不被改变。因而使最初的DNA进行了如此转变，使最初不能依靠其杂交性质与胞嘧啶区分的甲基胞嘧啶现在可以作为单独剩余的胞嘧啶而通过“标准的”分子生物学技术进行探测，例如通过扩增和杂交或测序。所有这些技术都基于碱基配对，就此碱基配对得到充分利用。涉及灵敏度的现有技术是通过一种方法定义的，该方法将所研究的DNA结合到琼脂糖基质上，借此防止了DNA的扩散和复性(亚硫酸氢盐只能在单链DNA上反应)，且所有的沉淀和纯化步骤都被快速的透析取代了(Olek A.，Oswald J.，Walter.J.，一种改良和提高的基于硫酸氢盐的胞嘧啶甲基化分析方法(A modifiedand improved method for bisulphate based cytosinemethylation analysis)，Nucleic Acids Res.1996年12月15日；24(24)5064-6)。用该方法可研究单独的细胞，这说明了该方法的潜力。然而至今仅研究了长度为约3000个碱基对的单独区域，对细胞进行完全研究以进行数千的可能的甲基化分析是不可能的。然而该方法也不能可靠地分析来自微量样品的非常小的片段，其尽管基质的扩散保护，但还是损失了。对探测5-甲基胞嘧啶的其它已知可能性的综述可源自下面的综述文章Rein T，DePamphilis ML，Zorbas H，鉴定DNA基因组中的5-甲基胞嘧啶和相关的修饰(Identifying 5-methylcytosineand related modifications in DNA genomes)，Nucleic AcidsRes.1998年5月15日；26(10)2255-64。至今亚硫酸氢盐技术仅应用于研究中，仅有少数例外(例如，Zeschnigk M，Lich C，Buiting K，Drfler W，Horsthemke B，用于基于SNRPN座位的等位甲基化差异对Angelman和Prader-Willi综合症进行诊断的单管PCR检验(A single-tube PCR test forthe diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome basedon allelic methylation differences at the SNRPN locus)，Eur J Hum Genet.1997年3月-4月；5(2)94-8)。然而，在亚硫酸氢盐处理之后已知基因的短的特定片段总是得到扩增，并且由“引物延伸反应”探测了或者经完全测序的(Olek A，Walter J，H19甲基化印记的植入前个体发生(The preimplantation ontogeny ofthe H19 methylation imprint)，Nat.Genet.1997年11月；17(3)275-6)或者单独的胞嘧啶位置(Gonzalgo ML，Jones PA，用甲基化敏感性单一核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)对特定位点上甲基化差异的快速定量(Rapid quantitation of methylationdifferences at specific sites using methylation-sensitivesingle nucleotide primer extension(Ms-SNuPE))，NucleicAcids Res.1997年6月15日；25(12)2529-31，WO专利9500669)或者酶的切割(Xiong Z，Laird PW，COBRA一种灵敏的定量DNA甲基化测定(a sensitive and quantitative DNAmethylation assay)，Nucleic Acids Res.1997年6月15日；25(12)2532-4)。此外还描述有依靠杂交进行的探测(Olek等人，WO 99/28498)。基因组DNA中的5-甲基胞嘧啶测序之前，尿素改进了亚硫酸氢盐处理的效率(Paulin R，Grigg GW，Davey MW，Piper AA，尿素改进了硫酸氢盐介导的对基因组DNA中5-甲基胞嘧啶测序的效率(Urea improves efficiency of bisulphate-mediatedsequencing of 5’-methylcytosine in genomic DNA)，NucleicAcids Res.1998年11月1日；26(21)5009-10)。其它有关用于在单个基因中探测甲基化的亚硫酸氢盐技术的应用的出版物为Grigg G，Clark S，基因组DNA中5-甲基胞嘧啶残基的测序(Sequencing 5-methylcytosine residues in genomicDNA)，Bioassays.1994年6月；16(6)431-6，431；Zeschnigk M，Schmitz B，Dittrich B，Buiting K，HorsthemkeB，Drfler W，人类基因组中印记的区段由基因组测序方法确定的Prader-Willi/Angelman综合症区域中的不同的DNA甲基化模式(Imprinted segments in the human genomedifferent DNAmethylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndromeregion as determined by the genomic sequencing method)，Hum Mol Genet.1997年3月；6(3)387-95；Feil R，CharltonJ，Bird AP，Walter J，Reik W，单独染色体的甲基化分析硫酸氢盐基因组测序改进的规程(Methylation analysis onindividual chromosomesimproved protocol for bisulphategenomic sequencing)，Nucleic Acids Res.1994本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在ＤＮＡ样品中探测胞嘧啶甲基化的方法，其特征在于，进行了下面的步骤：将包含所研究的ＤＮＡ和背景ＤＮＡ的基因组ＤＮＡ样品以这样一种方式进行化学处理，从而使得所有非甲基化的胞嘧啶碱基都转变为尿嘧啶，而５－甲基胞嘧啶碱基保持不变； 用至少２个引物寡核苷酸和一个聚合酶对经化学处理的ＤＮＡ样品进行扩增，其中所研究的ＤＮＡ相对于背景ＤＮＡ是优选被作为模板的，并且分析扩增产物，并从扩增产物的存在性和／或从对其它位置的分析中推断所研究的ＤＮＡ中的甲基化状态。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A奥莱克，K伯林，
申请(专利权)人：EPI基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]