本发明专利技术的光检测装置包括：在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在油中的多个液滴(4)沿线状的流移动而成的；激光束照射部，其在流路部的多个流柱排列的方向上导入激光束(3)，对多个流柱进行照射；和光检测部，其从与排列平面垂直的方向检测因激光束的照射而从多个流柱产生的发光。油的折射率(no)与液滴的折射率(nd)之差为‑0.02≤nd‑no≤0.05。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】光检测装置
本专利技术涉及在油中将样品分割为大量的液滴之后进行分析的光检测装置。
技术介绍
近年来，在油中将样品溶液分割为体积从皮升至纳升等级的液滴1万个～1千万个，在各液滴的内部发生基于样品成分的反应，检测各液滴的反应结果，由此来高精度、高灵敏度地进行样品的分析的液滴数字分析法备受瞩目。分析对象有核酸、蛋白质等各种各样，但控制成绝大多数的液滴中含有0个或1个分析对象，由此具有得到源自单一分析对象的反应结果，或者能够定量样品中所含的分析对象的绝对个数的优点。通过控制成例如各液滴中含有0个或1个构成样品的细胞，能够定量源自单一细胞的特定抗原量的平均值和方差，或者能够定量源自单一细胞的基因突变的比例。其中，应用于PCR的液滴数字PCR(以下称为ddPCR(dropletdigitalPCR))已经显着发展，并且预期不仅被应用于研究领域，而且被应用于诊断领域。作为现有的定量PCR的主要方法的实时PCR，通过逐次测量每个热循环的扩增反应的进行度来定量样品中原本存在的分析对象基因。但是，为了实施该方法，需要事先测量分析对象基因的各个稀释系列的相对于热循环次数扩增反应的进行度，将其用作校准曲线。但是，在样品中的分析对象基因的扩增效率与取得校准曲线时的扩增效率不同的情况下，会发生定量结果与事实不同的情况。与之相对地，ddPCR由于数字计数样品中原本存在的分析对象基因来定量，所以不需要校准曲线，不容易受到分析对象基因的扩增效率的变化所致的影响，因此是简便且高精度的定量PCR。例如在从试样提取基因组后，按每个PCR试剂将其分割成大量的液滴，并进行数字化的PCR扩增反应。使用根据有无突变而发出荧光的TaqMan探针等，测量单个液滴的荧光并对阈值以上的荧光进行数字计数。通过采用大量的液滴能够以比较低的成本看到低频度的基因突变，这方面非常优秀。当前，作为ddPCR装置，产品化的有Bio-Rad公司的QX200、RainDanceTechnologies公司的RainDrop等。各种ddPCR装置都是同样的机制。Bio-Rad公司的ddPCR装置的机制如非专利文献1的图1所示。首先，将含有PCR试剂的样品20微升和油放入设置于ddPCR装置的树脂制的液滴形成盒中，利用负压吸引和流动聚焦喷嘴机构在油中形成1纳升体积的液滴2万个左右。各液滴通过添加表面活性剂而在油中稳定化。接着，将油中的大量的液滴用移液管移动到现有的微量滴定板上的一个孔中，并使用现有的热循环仪执行PCR直到滴定终点(endpoint)。接着，再次在ddPCR装置中，一边负压吸引油中的大量的液滴一边使之在形成于树脂制的微芯片内的通道中排成一排而流动，进而在通道中追加油由此扩大液滴间隔使之流动，通过对通道照射激光光束来依次照射各个液滴，依次测量来自各个液滴的发光荧光。在此，在PCR前包含分析对象基因的液滴在PCR后受到扩增而发出强的荧光，与之相对地，在PCR前不包含分析对象基因的液滴在PCR后不受到扩增而仅发出弱的荧光。即，通过对荧光强度设定适当的阈值，对具有超过阈值的荧光强度的液滴的个数、具有低于阈值的荧光强度的液滴的个数分别进行数字计数，高精度地定量样品中所含的分析对象基因的绝对量。另一方面，在ddPCR中，使用矿物油，硅油，氟油等各种油，但通常由于油和液滴的折射率不同，所以当对液滴照射激光束时，会在界面处发生散射。专利文献1中提案有，为了避免或减少这种液滴界面处的散射，使油和液滴的折射率一致或接近。由此，能够以高灵敏度检测源自存在于液滴内部的细胞的散射光。现有技术文献专利文献专利文献1：WO2015/015199A2非专利文献非专利文献1：Anal.Chem.2011，83，8604-8610
技术实现思路
专利技术要解决的课题当前，在已经产品化的所有ddPCR装置中，PCR前的液滴形成的工序是对8个样品并行地进行，而PCR后的液滴的荧光检测工序由于是对各样品依次进行，所以需要更长的时间。例如，在RainDanceTechnologies公司的RainDrop中，根据其产品手册，8个样品的液滴形成用约30分钟完成，而各样品的荧光检测分别需要约30分钟，所以8个样品的荧光检测需要约4小时。为了以更高的灵敏度、更高的精度和更宽的动态量程进行分析对象的检测，只要对各样品形成更大量的液滴即可，但是如果这样做，液滴形成和荧光检测的各工序所需的时间之差进一步扩大。另外，在要分析的样品的个数超过8个的情况下，例如在分析96个样品的情况下，液滴形成工序的并行度提高到12倍，同样在30分钟完成该工序比较容易，但是由于荧光检测工序难以并行化，所以需要12倍的约48小时这样不切实际的时间。即，ddPCR装置的液滴的荧光检测的工序是限制整体速度的工序，如果能够使该工序的吞吐量增大，则不仅能够大幅缩短现有的分析时间，而且能够在切实际的时间内完成更高的灵敏度、更高的精度和更宽的动态量程的分析。为了使ddPCR装置的液滴的荧光检测的工序的吞吐量增大，尽管只要使本工序并行化即可，但是由于荧光检测系统大而昂贵，所以如果将荧光检测系统简单地并行化，则等同于将ddPCR装置本身并行化，是不切实际的。于是，本专利技术的目标在于，不大幅增大荧光检测系统的大小和成本，排列多个通道并且并行地不会降低速度和灵敏度地对在各通道中流动的液滴进行荧光检测。更具体地说，目标在于，将多个通道平行地排列在同一个微芯片内的同一个平面上，通过与各通道的长轴垂直且沿上述排列平面照射的“激光束横向入射”，来照射各通道，并从与上述排列平面垂直的方向检测来自在各通道内流动的各液滴的发光荧光。但是，在尝试上述的激光束横向入射的结构时，由于激光束的散射和折射的影响，其结果并不好。如后所述，进行精密的探讨的结果，发现大致有两个独立的原因。第一个原因在于，由于在各通道中流动的液滴与油之间存在折射率差，所以各液滴起到凹透镜或凸透镜的作用，而且这种透镜在横穿激光束的方向上移动，所以激光束从入射轴扩散或其行进方向变动，而无法有效地使激光束到达后段的通道。在专利文献1中，尽管提案有通过使液滴与油的折射率一致或接近来避免或者减少激光束的液滴界面的散射的方案，但是该文献的探讨的目的在于高灵敏度地检测源自在单个通道流动的液滴中所含的细胞的散射，并不像以用激光束横向入射来对在本专利技术作为对象的多个通道流动的液滴进行荧光检测为目的。另外，在该文献中，对于液滴与油的折射率差、和液滴的透镜效应所致的激光束的行为的关系完全没有进行定量分析。即，液滴和油的折射率各自的值是多少、它们的折射率差是多少时，对于多个通道的激光束横向入射较好地进行或者不能较好地进行，是不明了的。第二个原因在于，形成在微芯片内的各通道的两个侧表面不垂直于各通道的排列平面，而是倾斜成锥形，并且液滴或油的折射率与微芯片的部件的折射率不同，所以激光束随着通过多个通道的侧面会向一个方向折射，从上述的排列平面散逸。本专利技术通过分别解决上述两个原因，提案一种用于实现对于液滴和油所流动的多个通道的激光束横向入射的方法。用于解决课题的技术方案本专利技术的光检测装置包括：在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在油中的多个液滴沿线状的流移动而成的；激光束照射部，其在流路部的多个流柱排列的方向上导入激光束，对多本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种光检测装置，其特征在于，包括：在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在油中的多个液滴沿线状的流移动而形成的；激光束照射部，其在所述流路部的所述多个流柱所排列的方向上导入激光束，对所述多个流柱进行照射；和光检测部，其从与所述排列平面垂直的方向检测因所述激光束的照射而从所述多个流柱产生的发光，所述油的折射率no与所述液滴的折射率nd之差为‑0.02≤nd‑no≤0.05。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种光检测装置，其特征在于，包括：在排列平面上保持多排流柱的流路部，其中所述流柱是分散在油中的多个液滴沿线状的流移动而形成的；激光束照射部，其在所述流路部的所述多个流柱所排列的方向上导入激光束，对所述多个流柱进行照射；和光检测部，其从与所述排列平面垂直的方向检测因所述激光束的照射而从所述多个流柱产生的发光，所述油的折射率no与所述液滴的折射率nd之差为-0.02≤nd-no≤0.05。2.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：所述油的折射率no与所述液滴的折射率nd之差为-0.01≤nd-no≤0.03。3.如权利要求1所述的光检测装置，其特征在于：所述液滴的折射率nd为nd＝1.33，所述油的折射率no为1.30≤no≤1.34。4.如权利要求1～3中任一项所述的光检测装置，其特征在于：所述多个流柱形成于排列在微芯片内的所述排列平面上的多个通道的内部，所述多个通道的截面形状为四边形，所述激光束所透射的侧面与所述排列平面所成角度在90±1.5度的范围内。5.如权利要求4所述的光检测装置，其特征在于：所述多个通道在所述照射的所述激光束的光轴方向的宽度小于所述液滴为球状时的球的直径。6.如权利要求1～3中任一项所述的光检测装置，其特征在于：所述多个流柱形成于在空气中排列在所述排列平面上的多个毛细管的内部，所述多个毛细管的外径为227μm以下。7.如权利要求1～3中任一项所述的光检测装置，其特征在于：所述多个流柱形成于在空气中排列在所述排列平面上的多个毛细管的内部，所述多个毛细管的内径为25μm以上。8.如权利要求1～3中任一项所述的光检测装置，其特征在于：所述多个流柱形成于在空气中排列在所述排列平面上的多个毛细管的内部，所述多个毛细管的外径相对于内径的比率为4.5以下。9.如权利要求6～8中任一项所述的光检测装置，其特征在于：所述多个毛细管的内径小于所述液滴为球状时的球的直径。10.如...
【专利技术属性】
技术研发人员：穴泽隆，小原贤信，植松千宗，后藤佑介，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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