从血液制品和/或其衍生物中浓缩和检测致病微生物的装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及一种浓缩血液制品或其衍生物中可能存在的致病微生物以及检测浓缩的所述微生物的方法。所述方法包括如下步骤：（ａ）将所述血液制品的样品进行血细胞聚集处理，（ｂ）将步骤（ａ）中形成的聚集物通过将处理的样品经过第一个过滤器而消除，所述过滤器允许污染微生物通过但不允许细胞聚集物通过，（ｃ）将步骤（ｂ）中获得的滤液中的残余细胞选择性裂解，（ｄ）通过将步骤（ｃ）的裂解物通过第二个过滤器回收污染微生物，从而检测可能被捕获的污染微生物。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种浓缩血液制品或其衍生物中可能存在的致病微生物以及检测浓缩的所述微生物以监测所述血液制品的致病性的方法。术语“血液制品”是指全血以及从所述全血的级分中产生的任何制品，任选地包含细胞成分，以下列出了血液制品的实例浓缩的红细胞或血小板，但也包括血浆或血清制品。检测由不同的致病微生物如细菌，病毒，霉菌，酵母及其它微生物对血液制品及其衍生物的污染，是公共卫生机构以及输血行业面临的主要问题。目前存在一些检测试验，但不能常规使用。检测一群或一亚群血液细胞中这些致病微生物的大多数试验存在的主要问题包括这样的事实，即设想用于选择性提取所述致病微生物的大多数处理同时导致这些微生物被消除。这种消除几乎系统地导致所测试的血液制品中所述微生物的存在不可测得，从而增加了对健康的危及。因此本申请人设计可一种新的快速灵敏的方法，以检测血液制品或其衍生物中致病微生物的污染情况。本专利技术的方法值得注意之处是其直接对从采自研究对象的血液制品中获得的样品进行检测，不用预先处理或稀释。本申请人揭示的检测致病微生物的方法基本由以下步骤组成选择性浓缩所述致病微生物，然后一旦其被浓缩则通过本领域熟知的方法检测。选择性浓缩致病微生物通过相继或同时消除血液制品样品中存在的不同血细胞群而进行。本专利技术浓缩致病微生物的方法包括第一步浓缩致病微生物，即通过选择性聚集血细胞群而减少这些细胞，随后进行过滤步骤以收集滤液中未聚集的浓缩的致病微生物，而血细胞聚集物保留在过滤器上。本专利技术中所用术语“聚集(aggregation)”是指导致细胞聚集物形成的任何作用。术语“细胞聚集物”是指包含两个以上细胞的任何细胞群体，其大小大于一个独立的细胞。在本专利技术中，聚集物可以通过聚集获得，如血小板激活后聚集，聚集物也可通过凝集(agglutination)获得，如获得的红细胞当存在特定分子时会凝集，或者聚集物可以通过改变细胞膜的静电电荷或其它粘附机制诱导的细胞群聚而获得，或者聚集物可以通过引起两个以上的细胞群聚的细胞群聚而获得。根据本专利技术的优选实施方案，不同血细胞群的聚集可以通过诱导血小板聚集的化合物或者通过诱导红细胞特异性凝集的化合物而进行。例如已知在存在一些化合物的情况下，血小板具有彼此聚集的能力。这些聚集物可易于通过过滤与致病微生物分离。红细胞也存在一些凝集性质。本专利技术浓缩致病微生物的方法任选包括第二个步骤降低血液中主要细胞群即血小板和红细胞的浓度，所述步骤包括裂解在第一步聚集步骤中分离的未聚集的细胞。降低血细胞群浓度的该第二个步骤使得血小板的浓度降低4log(从109降至105个细胞/ml)，红细胞浓度降低5log(从1010降至105)。更精确而言，本专利技术的目的是提供一种浓缩可能存在于包含血细胞的血液制品中的污染微生物的方法，所述方法特征在于其包括以下步骤a)将所述血液制品的样品进行血细胞聚集处理，b)将步骤a)中形成的聚集物通过将处理的样品经过第一个过滤器而消除，所述过滤器允许污染微生物通过但不允许细胞聚集物通过，c)将步骤b)中获得的滤液中的残余细胞选择性裂解，d)通过将步骤c)的裂解物通过允许细胞碎片通过的第二个过滤器回收污染微生物。根据本专利技术的优选实施方案，本专利技术的方法包括一个补充步骤e)，即对第二个过滤器进行分析以检测可能保留在其上的污染微生物。本专利技术的检测方法优选包括在聚集步骤a)期间加入污染微生物的标记试剂，或者在裂解步骤c)期间加入污染微生物的标记试剂，或者在分析步骤e)期间直接在第二个过滤器上加入污染微生物的标记试剂。作为通过本专利技术方法可检测的致病微生物的标记试剂的实例，我们可以列举出一种标记溶液，其含有一种酯酶底物如ChemChrome V6。因此，作为通过本专利技术方法可检测的致病微生物的标记试剂，可以使用一种包含标记抗体或核酸标记的一种标记溶液。所述标记优选是荧光标记或者与荧光染料或能使底物降解而产生荧光的酶偶联，所述荧光可以通过激发激光而检测。本专利技术的检测方法还包括加入污染微生物的透化剂，透化剂可以加入所述方法的至少一个步骤中，在聚集步骤a)期间加入，或者在裂解步骤c)期间加入，或者在分析步骤e)期间直接加入在第二个过滤器上，或者在几个这些步骤期间均加入。作为污染微生物的透化剂的实例，我们可以列举出聚乙烯亚胺，氯己定二醋酸盐(chlorhexidine diacetate)，氯己定二葡糖酸盐，乙二胺四乙酸(EDTA)单独或者与乳链菌肽组合，以及去污剂如N-辛基-β-D-吡喃葡糖苷，SDS，Tween，triton，Brij等。根据本专利技术方法的一个特定实施方案，血液制品的血细胞是血小板或红细胞或者是这两种细胞的混合物。根据本专利技术方法的另一个特定实施方案，血液制品的血细胞是血小板，步骤a)的聚集处理包括将样品与一种聚集组合物接触，所述组合物包含选自以下一组的至少一种聚集剂-一种血小板抗原的特异性抗体，-选自以下的一种血小板激活的强激动剂凝血酶，TRAP(凝血酶受体激活肽)，胰蛋白酶，胶原蛋白，血栓烷A2或者离子载体A23187，-选自以下的一种血小板聚集的弱激动剂ADP，肾上腺素(adrenalin)，花生四烯酸，Von Willebrand因子，5-羟色胺或肾上腺素(epinephrine)。聚集组合物中血小板抗原的特异性CD9抗体的浓度有利地在0.5μg/ml至100μg/ml之间，优选在5μg/ml至40μg/ml之间。聚集组合物中强激动剂的浓度有利地-对于凝血酶型激动剂，在0.5IU/ml至100IU/ml之间，优选在1IU/ml至20IU/ml之间；-对于TRAP型激动剂，在5μM至200μM之间，优选在10至100μM之间；-对于胰蛋白酶型激动剂，在1nM至500nM之间，优选在10nM至300nM之间；-对于胶原蛋白型激动剂，在0.05μg/ml至50μg/ml之间，优选在1μg/ml至20μg/ml之间；-对于血栓烷A2型激动剂，在0.01μg/ml至5μg/ml之间，优选在0.1至1μg/ml之间；-对于PAF型激动剂，在0.005mg/ml至1mg/ml之间，优选在0.05至0.5mg/ml之间；-对于离子载体A23187型激动剂，在0.1μM至100μM之间，优选在1μM至20μM之间。聚集组合物中弱激动剂的浓度有利地-对于ADP、肾上腺素(adrenalin)或肾上腺素(epinephrine)型激动剂，在0.5μM至100μM之间，优选在1μM至20μM之间；-对于花生四烯酸型激动剂，在0.001mM至10mM之间，优选在0.01mM至5mM之间；-对于Von Willebrand因子型激动剂，在0.001mg/ml至1mg/ml之间，优选在0.01mg/ml至0.5mg/ml之间；-对于5-羟色胺型激动剂，在0.05μM至100μM之间，优选在0.01μM至50μM之间。在一个完全优选的方式中，血小板抗原的特异性抗体选自抗-CD，CD32，抗-PTA1，CD42，抗-GpIIb/IIIa或抗-GpIV抗体。根据本专利技术方法的另一个特定的实施方案，血液制品包含红细胞，聚集处理步骤a)包括将样品与一种凝集组合物接触，所述凝集组合物包含选自凝集素，聚乙烯亚胺，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，凝胶，葡聚糖或本文档来自技高网...

【技术保护点】
浓缩可能存在于包含血细胞的血液制品中的污染微生物的方法，其特征在于包括以下步骤：ａ）将所述血液制品的样品进行血细胞聚集处理，ｂ）将步骤ａ）中形成的聚集物通过将处理的样品经过第一个过滤器而除去，所述第一个过滤器允许污染微生物通 过而不允许细胞聚集物通过，ｃ）将步骤ｂ）中获得的滤液中的残余细胞选择性裂解，ｄ）通过将步骤ｃ）的裂解物经过允许细胞碎片通过的第二个过滤器而回收污染微生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：让皮埃尔埃尔梅，伊莎贝尔贝松福尔，塞巴斯蒂安里博，扬戈德弗兰，安妮莫诺德安格莱斯，
申请(专利权)人：海默系统公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]