一种抗生素的筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种抗细菌药物的筛选方法。传统上抗生素是根据抑菌能力来筛选的。本发明专利技术的包括以下步骤：合成致病细菌核糖体核酸作为抗生素筛选的靶标固定在载体Ａ上；将核酸随机片段固定在载体Ｂ上；将待筛选物质溶解于缓冲液中；用固定有核酸随机片段的载体Ｂ吸附去除待筛选物浓缩液中的非特异性结合物；用固定有靶标的载体Ａ捕获待筛选物浓缩液中的特异性结合物；用洗脱液洗下结合在靶标上的特异性结合物，进行抑菌试验；对有抑菌能力的特异性结合物进行分离纯化。采用本发明专利技术方法可以筛选出能特异抑制某菌生长的专一性抗生素，也可以筛选出能抑制各类细菌生长的广谱抗生素。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗细菌药物的筛选方法。
技术介绍
随着抗生素的广泛使用，微生物的抗药性也逐渐增强。据报道，目前分离的金黄色葡萄球菌有90％以上能产生β-内酰胺酶，能抗青霉素类药物，随着甲氧西林(methicillin)的替代使用，对甲氧西林有抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)迅速产生，由于各类抗药性在菌株间的不断积累和转移。至目前，只有糖肽类抗生素仍保持着对MRSA的活性。但Hiramatsu已分离到一株对万古霉素(vancomycin，属糖肽类抗生素)有抗性的MRSA菌株，虽然抗性机理还不太清楚，但一旦这种抗性扩散，对MRSA菌株的感染可能就无药可用了。与此同时，环境污染的加剧，社会和人文的变迁使人类的免疫力不断下降，新的致病菌和条件致病菌不断出现，先前不被认为是由细菌引起的疾病，如胃痉挛、心脏病等也被发现可由细菌引起。这种微生物日益增强的抗药性和新致病菌的不断出现已经成为一个严重的社会问题，要解决这一问题，最有效的办法就是加大力度，筛选开发新的抗生素。但是新药的开发已越来越难。究其原因，主要是缺乏新型的筛选靶标和有效的筛选方法。传统上抗生素是根据抑菌能力来筛选的，随着对抗生素作用机理的认识，逐渐发展出以必需酶、受体、离子通道等为靶标进行筛选的方法。近年来，由于人类基因组和微生物基因组工作的进展，新的靶标不断出现，再加上高通量筛选方法的建立，使新药筛选工作获得了快速的发展。理想的靶标应该是细胞存活所必需的，在病原菌中高度保守，而在人体中不存在或差异很大的物质。目前所用的靶标绝大多数是具有明确生化功能的蛋白质，这类靶标虽然筛选相对容易，但存在着一个缺点，即对找到的抗生素，细菌可能会通过作用位点(靶标)的突变来产生抗药性。RNA作为靶标来筛选抗生素的工作目前已越来越受到关注，Echer认为就靶标而言，RNA的价值要比基因组大一倍，Steven也认为用RNA作靶标筛得的抗生素抗药性发展较慢。实际上，氨基糖苷类抗生素就可通过与核糖体16S rRNA的A位点结合而发挥作用。研究表明，编码16S rRNA的基因(rDNA)全长约1500bp，由一系列保守区和可变区间隔而成，这些保守序列在千百万年的进化过程中几乎没发生过变化，如1351～1369位(以大肠杆菌为标准)是G-菌的保守区，1401～1419位是G+菌的保守区，1167～1189位在所有细菌中都保守。链霉素与rRNA的结合位点是由16S rDNA的非保守区编码的，因此当rRNA上的第524位由鸟嘌呤(G)突变成胞嘧啶(C)时，链霉素就不能很好地与之结合，细菌就产生了对链霉素的抗性。如果以rRNA的保守序列作靶标去筛选抗生素，将会大大减小这类抗药性的产生。RNA除了可与一些小分子物质结合外，还能与蛋白质(RNA-bindingproteins)、反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides)结合。不过大多数蛋白质和反义寡核苷酸分子量较大，很难进入病原微生物的细胞内，如果能从微生物代谢产物中筛选到可与RNA特异结合的多肽类物质，将有可能成为具有应用前景的抗生素。除了蛋白质和RNA外，DNA在细菌的生命活动过程中也扮演着非常重要的角色。但用DNA作靶标筛选抗生素的工作还没有受到重视，主要原因是目前发现的作用于DNA的抗生素大都缺乏选择毒性。但DNA作为靶标的潜力值得关注。研究表明某些物质可与DNA发生特异性结合，如大肠杆菌乳糖操纵子中的阻遏蛋白可识别一段26bp的DNA序列并与之结合。Carrasco证实抗癌抗生素AT2433-B1能与特定DNA序列相识别。Charles发现卡那霉素和新霉素的异硫氰酸盐可共价连接于特定的DNA片段上。因此，如果以rDNA的保守区为靶标去筛选能与之发生特异性结合的物质，有可能开发出能专一性地抑制细菌生长而不影响人体DNA功能的抗生素。由于rRNA与rDNA的负链除了U取代T外，其它都一样，因此，以其保守序列为靶标筛选得到的抗生物质进入细胞后，除能与rRNA结合影响核糖体的组装，破坏核糖体的功能外，还有可能与DNA结合抑制复制的进行；而且这些作为靶标的区域在细菌中高度保守，因作用靶标变异而产生的抗药性几乎不太可能发生。由此而筛选得到的抗生素不仅在医疗领域，而且在食品保鲜、物品防腐等方面具有巨大的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所解决的技术问题是提供了一种基于原核生物核糖体核酸为靶标的抗细菌药物筛选方法，建立了基于细菌核糖体核酸，特别是其中的保守序列为靶标的新型抗生素筛选模型。本专利技术主要包括以下步骤1)合成致病细菌核糖体核酸(包括16S rRNA、16S rDNA、23S rRNA或23S rDNA全序列中至少含18个碱基的序列，特别是其中的保守片段)作为抗生素筛选的靶标，将上述靶标固定在载体A上；2)将核酸随机片段(含8～12个碱基)固定在载体B上；3)将待筛选物质浓缩后溶解于缓冲液中；4)用固定有核酸随机片段的载体B吸附去除待筛选物浓缩液中的非特异性结合物；5)用固定有靶标的载体A捕获待筛选物浓缩液中的特异性结合物；6)用洗脱液洗下结合在靶标上的特异性结合物，进行抑菌试验；7)对有抑菌能力的特异性结合物进行分离纯化，得到抗生素候选物。核糖体核酸及核酸随机片段的合成为一项成熟技术，本专利技术所需的细菌核糖体核酸及核酸随机片段可以在研究室合成，也可以向生物技术公司购买。本专利技术可以以某一种特定致病菌的16S rRNA或23S rRNA为靶标筛选能与之特异结合的专一性抗生素，如以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的16S rRNA或23S rRNA为靶标筛选对这类致病菌有特异抑制作用的专性抗生素；也可以以某一类致病菌共有的rRNA保守序列为靶标筛选广谱抗生素，这些保守序列可以来自16S rRNA(或16S rDNA)，也可以来自23S rRNA(23SrDNA)。如来自16S rRNA在所有细菌中都保守的AGAGUUUGAUCCUGGCUCAG、GGUUACCUUGUUACGACUU和AGGAGGUGAUCCAACCGCA；或是来自16S rRNA在革兰氏阳性致病菌中保守的如GGCUUCUGCUGUUACAAA，或是来自16S rRNA在革兰氏阴性致病菌中保守的如CCCGGCUUCGUAUUCACC，或是来自16S rRNA只在某一类病原菌如立克次氏体中保守的序列如UAAUGCCGGGAACUAUAAGAA；或是来自23S rRNA在所有细菌中都保守的序列如UUCGCCUUUCCCUCACGGUACU等。本专利技术采用的细菌核糖体核酸序列可以是人工合成的保守片段(至少含18个碱基)，或是以27F，1492R为引物经聚合酶链反应(PCR)合成的16S rDNA全序列，或是以其他引物经PCR合成的16S rDNA部分序列，也可以是来自23S rRNA的序列。本专利技术采用的靶标固定化材料可以是在southern blotting中常用的硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜，可以是在基因芯片中常用的玻璃或硅片，可以是核酸亲和层析中常用的纤维素或Sepharose，也可以是其他能吸附核酸的材料，如琼脂糖，羟基磷灰石，聚丙烯等。本专利技术所使用的随机片段由A、T(U)、G、C四种碱基随机组装而成，长度约为10个碱基。本专利技术将上述核本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗生素的筛选方法，其特征在于该方法包括以下步骤：１）以细菌核糖体核酸作为靶标，将其固定在载体Ａ上；２）将核酸随机片段固定在载体Ｂ上；３）将待筛选物质浓缩后溶解于缓冲液中；４）用固定有核酸随机片段的载体Ｂ吸附去除待筛选物浓缩液中的非特异性结合物；５）用固定有靶标的载体Ａ捕获待筛选物浓缩液中的特异性结合物；６）用洗脱液洗下结合在靶标上的特异性结合物，进行抑菌试验；７）对有抑菌能力的特异性结合物进行分离纯化，得到抗生素候选物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴根福，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]