新型启动子制造技术

本发明专利技术在于提供一种适于目的基因的高表达的启动子。由选自下述(a)～(d)中的DNA构成的启动子：(a)由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA；(b)由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有至少70％的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；(c)由在序列编号1～3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；和(d)与由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型启动子
本专利技术涉及新型启动子、含有该启动子的表达载体和转化体、以及使用了该转化体的目的物质的制造方法。
技术介绍
近年来，不仅化学合成法，也在工业水平上进行着使用生物、酶的物质合成法。利用生物、酶的物质合成与化学合成法相比，能够降低合成时的能量，并且能够特异合成具有光学异构体的化合物中特定的结构。另一方面，在利用微生物的有用物质的工业生产中，其生产率的提高是重要的课题之一。以往，作为用于提高微生物的物质生产率的方法，进行了利用突变等的遗传学方法的生产菌的育种。特别是最近，由于微生物遗传学和生物工序的发展，使用了基因重组技术等的更高效的微生物学有用物质生产备受关注。作为丝状菌的根霉属(Rhizopus)，至今作为能够用于乳酸生产的微生物被公开(专利文献1～3)。但是，根霉属菌的遗传学的背景仍不清楚，分子遗传学方法的导入慢，预想其为多核细胞因而单克隆系统的分离、维持困难，因此，基因重组技术等相关的研究例少。作为根霉属菌中基因的转录必要的启动子，报道了ldhA启动子(专利文献1、非专利文献1)、pgk1启动子(专利文献2、非专利文献2)、pgk2启动子(专利文献3)、pdcA和amyA启动子(非专利文献2)、tef和18SrRNA启动子(专利文献4)等，为了不必全面地研究这些启动子的表达强度、并且降低工业生产时的生产成本，要求能够实现更高的生产率的启动子和微生物。(专利文献1)美国专利第6268189号说明书(专利文献2)国际公开第2001/73083号(专利文献3)国际公开第2001/72967号(专利文献4)美国专利申请公开第2010/112651号说明书(非专利文献1)AppliedMicrobiologyandBiotechnology(2004)vol.64:237-242(非专利文献2)ArchivesofMicrobiology(2006)vol.186:41-50
技术实现思路
在一个方式中，本专利技术提供由选自下述(a)～(d)中的DNA构成的启动子：(a)由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA；(b)由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有至少70％的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；(c)由在序列编号1～3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；和(d)与由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。在另外的一个方式中，本专利技术提供含有上述启动子的表达载体。在另外的一个方式中，本专利技术提供包含编码目的物质或与其合成相关的酶的基因和连结于该基因的上游的上述启动子的DNA片段。在另外的一个方式中，本专利技术提供含有上述表达载体或DNA片段的转化体。在另外的一个方式中，本专利技术提供目的物质的制造方法，其包括：培养上述转化体；和从通过该培养得到的培养物回收目的物质。具体实施方式在本说明书中，碱基序列的同一性是指根据需要在进行比较的两个碱基序列插入间隙并进行比对(alignment)而得到的最大的碱基序列的同一性(％)。在本专利技术中，碱基序列和氨基酸序列的序列同一性通过Lipman-Pearson法(Science,1985,227:1435-1441)进行计算。具体而言，使用遗传信息处理软件Genetyx-Win的同源性分析(Searchhomology)程序，使Unitsizetocompare(ktup)为2进行分析，由此算出。在本说明书中，“启动子活性”是指促进DNA(基因)向mRNA的转录的活性。启动子活性能够通过使用适当的报告基因进行确认。例如，在启动子的下游连结编码能够检测的蛋白质的DNA、即、报告基因，通过测定该报告基因的基因产物的生产量，能够确认启动子活性。作为报告基因的例子，可以列举β-半乳糖苷酶(LacZ)基因、β-葡糖苷酸酶(GUS)基因、荧光素酶基因、β-内酰胺酶基因、GFP(绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein))基因等的荧光蛋白质的基因等。或者，启动子活性也能够通过以定量RT-PCR等测定从报告基因转录的mRNA的表达量来确认。在本说明书中，对于微生物的机能、性状、形质所使用的用语“本来”是用于表示该机能、性状、形质在该微生物的野生型中存在而使用。相对照而言，用语“外来”是用于表示原来在该微生物中不存在、从外部导入的机能、性状、形质而使用。例如，对某微生物从外部导入的基因为外来基因。外来基因可以为与其所导入的微生物同种的微生物由来的基因，也可以为异种的生物由来的基因(异种基因)。在本说明书中，基因相关的“上游”和“下游”是指该基因的转录方向的上游和下游。例如，“配置于启动子的下游的基因”是指在DNA正义链中基因存在于启动子的3'侧，基因的上游是指DNA正义链中该基因的5'侧的区域。另外，在本说明书中，启动子与基因的“能够工作的连结”是指以该启动子能够诱导该基因的转录的方式连结。启动子与基因的“能够工作的连结”的方法对于本领域技术人员来说是公知的。本专利技术涉及提供新型启动子、含有该启动子的表达载体和转化体、以及使用了该转化体的目的物质的制造方法。本专利技术的专利技术人对丝状菌由来的启动子进行了研究，结果发现了具有高的转录活性的新型启动子。本专利技术的启动子的转录活性高，能够显著提高作为控制对象的基因的转录量。采用本专利技术的启动子，能够提高目的物质的微生物学的制造的效率。在一个实施方式中，本专利技术的启动子为由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA。在另外的一个实施方式中，本专利技术的启动子包含由与由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA实质上同一的碱基序列、并且具有启动子活性的DNA。优选本专利技术的启动子相对于由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA的启动子活性，具有10％以上、优选15％以上、更优选50％以上、更优选70％以上、更优选80％以上、更优选90％以上的启动子活性。作为本专利技术的启动子的例子，可以列举由以下的(a)～(d)所规定的DNA构成的启动子。(a)由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA(b)由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有至少70％的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA(c)由在序列编号1～3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA(d)与由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA上述(a)的由序列编号1～3所示的碱基序列构成的DNA为根霉(Rhizopus)属由来的启动子。由序列编号1所示的碱基序列构成的DNA为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)由来的作为编码醇脱氢酶(ADH1)的基因的adh1的启动子。由序列编号2所示的碱基序列构成的DNA为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)由来的作为编码刀豆素应答酶(CIPC)的基因的cipC的启动子。由序列编号3所示的碱基序列构成的DNA为戴尔根霉(Rhizopusdelemar)由来的作为编码硫胺素合成酶(NMT1)的基因的nmt1的启本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种启动子，其中，所述启动子由选自下述(a)～(d)中的DNA构成：(a)由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA；(b)由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有至少70％的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；(c)由在序列编号1～3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；和(d)与由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.06 JP 2015-155759;2015.10.09 JP 2015-201181.一种启动子，其中，所述启动子由选自下述(a)～(d)中的DNA构成：(a)由序列编号1～3中任一项所示的碱基序列构成的DNA；(b)由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有至少70％的同一性的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；(c)由在序列编号1～3中任一项所示的碱基序列中缺失、取代或添加了1个或多个的碱基的碱基序列构成的、并且具有启动子活性的DNA；和(d)与由与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严格的条件下杂交、并且具有启动子活性的DNA。2.如权利要求1所述的启动子，其中，所述(b)所示的DNA为与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有80％以上的同一性的DNA。3.如权利要求1所述的启动子，其中，所述(b)所示的DNA为与序列编号1～3中任一项所示的碱基序列具有90％以上的同一性的DNA。4.一种表达载体，其中，所述表达载体包含权利要求1～3中任一项所述的启动子。5.如权利要求4所述的表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：金田实郎，壶井雄一，高桥史员，
申请(专利权)人：花王株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP