本发明专利技术属于动物基因工程技术领域，涉及一种利用改良ＡＳＰ（等位基因特异性ＰＣＲ）技术检测鸡Ｇｈｒｅｌｉｎ基因的多态性及其评价鸡的生长发育与产蛋性状的方法及其检测诊断试剂盒。主要步骤包括：从鸡血液或组织中提取基因组ＤＮＡ、设计引物、获得Ｇｈｒｅｌｉｎ基因部分序列，进行ＰＣＲ产物克隆测序、改良ＡＳＰ多态性检测、改良ＡＳＰ多态性与生产性状的关联分析，这些结果证实了Ｇｈｒｅｌｉｎ等位基因的存在与鸡生长发育与产蛋性状之间有显著关联。本发明专利技术还公开了用于扩增Ｇｈｒｅｌｉｎ基因片段特定序列的三对引物序列，以及该基因片段的碱基突变位点和ＡＳＰ多态性在鸡生长发育与产蛋（产蛋数和蛋重）性状上的检测、评价和应用，本发明专利技术为鸡的标记辅助选择和家禽育种提供了一种新的分子标记。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物基因工程
，具体地说，涉及利用鸡Ghrelin基因的ASP多态性与鸡的生长发育与产蛋(产蛋数和蛋重)性状相关联性能进行检测的方法，本专利技术还涉及到与鸡的生长发育和产蛋(产蛋数和蛋重)性状相关联的DNA序列以及应用该关联基因制备的检测诊断试剂盒。
技术介绍
在当前的家禽生产中，生长、产蛋和肉质是三个最重要的经济指标。其中生长指标是处于第一位的。之所以这样说是因为家禽生长的好坏直接决定和影响其繁殖(产蛋)性能和肉质品质。所以，家禽的生长发育一直是国内外学者研究的目标之一。但常规的表型、生理生化研究已经不能满足生产发展的需要。随着分子生物学的兴起，人们从分子水平上揭示基因和家禽生长发育、产蛋性状之间的关系已经成为了可能。而且，这些研究已经取得了丰硕的成果。基因或分子标记的研究已经并将继续扮演着重要的角色。对家禽的研究始于对其性状标记的研究。大致可分为三大类形态学标记、生理生化标记和分子标记。形态学标记包括颜色、大小、形状等。生理生化标记包括生理常数和血液生化指标等。分子标记包括染色体标记和DNA指纹标记。分子标记是近年来兴起的重要标记。它更直接、简便、快捷的反映了家禽的生活状态。尤其是DNA分子标记在当今家禽育种工作中是应用范围最广的标记类型。分子标记大致可分为三大类第一类是以分子杂交为核心的分子标记技术，包括限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、DNA指纹技术(DNA Fingerprinting)、原位杂交(in situ hybridization)等；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)为核心的分子标记技术，包括随机扩增多态性DNA标记(Random amplification polymorphism DNA，RAPD)、简单序列重复标记(Simplesequence repeat，SSR)或简单序列长度多态性(Simple sequence length polymorphism，SSLP)，也称微卫星(Microsatellite)，扩增片段长度多态性标记(Amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)、序列示踪位点(Sequence tagged sites，STS)、序列特征化扩增区域(Sequence charactered amplified region，SCAR)等；第三类是一些新型的分子标记，如单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)、表达序列标签(Expressedsequences tags，EST)等。2004年3月初，鸡的基因组序列草图诞生，它把人们推向了一个崭新的时代。但它却毕竟是一张草图。其序列缺口—“GAP”的填充和潜在SNPs位点的检测及其功能基因的鉴定给人们带来了新一轮的任务和挑战。世界各国的专家学者都在积极地开展相关的研究工作。对影响鸡生长发育与产蛋(产蛋数和蛋重)性状指标的“本质”—分子或基因的研究，无疑是最直接、最准确、最快速、最有意义的选择。其中的热点之一是SNP的研究，专门的人类SNP数据库已经展现在国际NCBI网站上。这些SNP标记为开展MAS(标记辅助选择)、早期育种，提高选种准确性和选育效率以及加速遗传进展提供了可靠的依据。对于鸡而言，特别是对可能影响着具有诸多优良特点的中国地方鸡种的相关基因潜在SNP的研究成了国内近两年来首当其冲的研究热点之一。而SNP的检测方法也层出不穷。最常用的有RFLP和SSCP(Single strand conformation polymorphisms，单链构象多态)等。但是，RFLP方法需要价格相对较为昂贵的限制性内切酶和严格的酶切条件；SSCP方法不要内切酶，可它的使用步骤繁琐而复杂，耗费大量的时间。所以，ASP(Allele Specific PCR，等位基因特异性PCR)方法应运而生，它综合了RFLP和SSCP的优点。等位基因特异性PCR(Allele Specific PCR，ASP)产生于九十年初，它有着简便、节时、高效等特点，不需酶切，不需要繁琐的步骤，仅仅两次PCR就可直接判型。但其引物难以设计、引物特异性低的特点也尤为突出，这是它不能得到广泛应用的主要原因之一。所以，一种引物设计自动化，特异化，实用化的改良ASP方法呼之欲出。1999年，Kojima等(Kojima M.，et al.Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptidefrom stomach.Nature.1999 Dec 9；402(6762)656-660.)首先在小鼠和人胃内分泌细胞及下丘脑弓状核中发现了Ghrelin基因(有人简写为GHR)编码蛋白—生长素(也有人成为“饥饿激素”)，它是生长激素促分泌素受体(GHS)的内源性配体。哺乳动物的生长素主要合成于胃，能特异性刺激垂体前叶释放生长激素(GH)，影响胃肠道和心血管功能及能量代谢，增加食欲进而促进生长。2002年，Hiroyuki Kaiya等(Kaiya，H.，S.，et al.Chicken ghrelinPurffication，cDNA cloning，and biological activity.Endocrinology.2002.1433454-3463.)分离纯化及克隆了鸡Ghelin基因，并首次公布了其包括完全编码区(Complete CDS)的mRNA序列。随后，聂庆华等(2003)和Tanaka等(2004)(WebsiteNCBI，nucleotide sequences.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi？db＝nucleotide&cmd＝search&term＝chicken+ghrelin.)先后公布了其包括完全编码区的DNA序列。鸡Ghelin基因包括5个外显子，4个内含子，其mRNA序列长843bp，编码26个氨基酸，而不同于人和鼠的28个氨基酸。Kaiya等(Kaiya，H.，S.，et al.Chicken ghrelinPurification，cDNA cloning，and biologicalactivity.Endocrinology.2002.1433454-3463.)研究表明，鸡Ghrelin基因mRNA也主要是在胃中表达，但却是在前胃而非后胃。同时，在脑部、肺部和肠部也有较低水平表达。但其功能不同于哺乳动物的是，它不仅能增加血浆中GH水平，而且还能增加血浆中肾上腺素水平。FuruseM等(Furuse，M.，et al.Intracerebroventricular injection of ghrelin and growth hormone releasingfactor inhibits food intake in neonatal chicks.Neurosci Lett.2001.301123-126本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测与鸡生长发育与产蛋性状相关的Ｇｈｒｅｌｉｎ基因的分子标记方法，其特征在于包括以下步骤：（１）在体外检测Ｇｈｒｅｌｉｎ基因中等位基因特异性ＰＣＲ（ＡＳＰ）等位基因是否存在；（２）通过测序和ＡＳＰ及凝胶电泳进行ＡＳＰ等位 基因的检测；（３）从鸡的全血或组织中提取基因组ＤＮＡ；（４）直接对基因组ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增检测多态性；（５）进行基因型与鸡生长发育及产蛋性状关联分析。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘榜，李长春，李奎，余梅，樊斌，李进，莫德林，徐日福，熊统安，朱猛进，强巴央宗，陈国宏，王克华，纪素玲，关迅，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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