【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在食品检验、流行病学环境检验、和临床检查中用于检测、鉴定并计算霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和最小弧菌(Vibrio mimicus)的方法。
技术介绍
霍乱弧菌在口腔感染后产生霍乱毒素并诱导剧烈的腹泻和呕吐。在某些情况下，感染性致病菌可导致感染患者死于极度脱水。人们认为对人类有毒的霍乱弧菌仅是O1霍乱，通过使用抗-O1抗体可使之凝集。人们还将不同于细菌的弧菌分为NAG(O1-不可凝集的)-弧菌其对人类无毒。然而，1995年在印度孟加拉地区，分离出了一种没有O1抗原的新型霍乱弧菌，它引起的症状与由传统霍乱引起的症状相似，揭示出该新的霍乱弧菌菌株具有被称作O139的新O-抗原。该菌株被称作孟加拉菌株且已被揭示出具有与传统O1霍乱相似的产生霍乱毒素的基因，其产生毒素并诱导霍乱。因此，已经表明除O1霍乱外的弧菌可使人类感染并引起霍乱。事实上，除了O1和O139菌株外，还存在具有霍乱毒素基因的霍乱弧菌菌株。这类菌株可在人类中诱导霍乱。然而，除O1和O139菌株外的霍乱弧菌菌株所致的症状作为感染性疾病还没有进行过药物治疗。 在此期间，在霍乱弧菌非-O1菌株中已经很少检测出非-糖分解菌株。Davis等人已经检测了所述菌株与霍乱弧菌的DNA同源性，由此显示所述菌株稍稍不同于霍乱弧菌并将所述菌株命名为最小弧菌。已经报道过最小弧菌是一种与霍乱弧菌密切相关的菌株。特别是，除了糖分解能力(霍乱弧菌是阳性的，最小弧菌是阴性的)外，两个种类的生化性质非常相似(J.Clin.Microbiol.14，631-639，1981)(非专利文献1)。已知在...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】5(2)和(3)以及权利要求11(2)和(7)描述的引物分别与表2中的CMgF、CMgR、CMrF、和CMrR相对应。使用从试验菌株中提取出来的染色体DNA作为模板、以及AmpliTaq Gold(PE Applied Biosystems)和总共20μl反应溶液进行PCR。关于热循环条件，是在95℃加热10分钟后，94℃ 1分钟循环35次、退火1分钟(见表5的退火温度)、和72℃ 1分钟，最后在72℃下进行延长反应10分钟。使反应后所得样品经过1％琼脂凝胶电泳，然后用溴化乙锭染色。是否存在扩增基因是在UV辐射下加以证实的。仅证实了来源于确定属于霍乱弧菌和最小弧菌的细菌菌株DNA的扩增产物，具有针对gyrB基因的CMgF和CMgR以及针对rpoD基因的CMrF和CMrR的组合(表6)。 下面给出利用对霍乱弧菌或最小弧菌特异的区域，使用按照本发明设计和获得的基因扩增引物(表3和表4所示)的例子。此外，权利要求19(1)、(3)、(4)、和(5)以及权利要求25(1)和(14)描述的引物对霍乱弧菌是特异性的。这些引物在表3中的CF1、CF2、CR2、CR1、CrF1、和CrR1描述。权利要求33(1)、(3)、(4)、和(5)以及权利要求39(7)和(13)描述的引物对最小弧菌是特异的。这些引物分别与表4中的MF1、MF2、MR2、MR1、MrF1、和MrR1相对应。 按照与实施例相似的方式，使用从试验菌株中提取出来的染色体DNA作为模板进行PCR(见表5的退火温度)。在所有情况下，使用霍乱弧菌-特异性引物仅检测来源于霍乱弧菌的扩增产物，而使用最小弧菌-特异性引物仅检测仅来源于最小弧菌的扩增产物(表6)。 表3.特异性检测霍乱弧菌的引物 表4.特异性检测最小弧菌的引物 表5.特异性检测霍乱弧菌和最小弧菌的引物的PCR条件 表6 此处引用的所有公开出版物、专利和专利申请全部引入此处作为参考。 工业实用性本发明的gyrB和rpoD基因引物和探针是以霍乱弧菌和最小弧菌的系统发育关系为基础设计的。因此，已经就提高特异性而研究了所述引物和探针且它们在检测准确性方面是极佳的。因此，所述引物和探针适用于在不从被密切相关的细菌种类污染的食品、临床样品等中分离细菌的情况下进行直接检测。 序列表<110>Nichirei Corporation<120>用于检测霍乱弧菌或最小弧菌的引物和探针以及使用它们的方法<130>PH-1967-PCT<140> <141> <150>JP 2002/362878<151>2002-12-13<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>885<212>DNA<213>人工序列<220> <223>人工序列的描述霍乱弧菌和最小弧菌的共有序列-gyrB<400>1gtmtccggyg gtctrcacgg ggtaggtgtg tcggtrgtka aygcsctbtc wgaaaaagtg 60ctrctbacca tytatcgygg yggcaaraty caywcscaaa cttaccatca yggtgtgcca 120caagcaccgt tgkctgtrgt rggtgakacw gagcgtaccg gtactaccgt acgtttctgg 180ccwagygcac aracytttac caatatcgaa ttycattacg acattytggc taaacgyctg 240cgtgagctgt cattcctgaa ytctggcgtg tcgatcaagc tgaysgatga rcgtgaagaa 300gataaraaag accacttyat gtatgaaggk ggtattcaag cgtttgtkac ccacttgaac 360cgyaayaaaa cgccratcca tgaraaagtm ttccacttya accaagagcg tgaagatggc 420atcagcgtgg aagtggcrat gcagtggaay gatggtttcc aagaaaacat ctactgcttt 480acyaacaaca tyccacagcg tgatggyggt acccayttag cyggtttccg tggtgcrttg 540acccgtactt tgaacaacta yatggayaaa gaaggcttct cgaagaaagc scaagcrgca 600acctcgggtg atgatgcgcg tgaaggctta acrgcdgtkg tdtcggtgaa agtrccrgat 660cctaaattct cragccaaac caaagataag 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600ttyatygcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargart ggctbgataa agtvctygct 660tctgayaarc cttaygtasm raaagtmcgt gagcaagaag amgakatycg ccgytcaaty 720caraaactdc aratgatcga rcargagacw tcactgtctg ttgarcgyat caaagacatc 780agccgtcgta tgtcwatcgg tgargcraaa gctcgccgtg cg 822<210>3<211>822<212>DNA<213>人工序列<220> <223>人工序列的描述霍乱弧菌的共有序列-gyrB<400>3acacgtgaag gygaaatcga tattgccaag cgcattgaag atggtattaa ccaagttcaa 60agtgcgattg ctgagtatcc tggaaccatc ccwtayattc ttgarcagtt tgaymrkgtt 120caggcmgaag arctacgtct sactgayctg atttcwggtt tcgttgaycc taacgacatg 180gaaaccgaag cgccaacygc kactcacatc ggttcwgarc tytctgaagc sgatctcgck 240gatgaagatg aygmkgtcgy sgargatgaa gacgargatg aagaygaaga yggcgacggt 300gaaagyagcg acagcgaaga agaagtsggt atygaccctg arctsgctcg tgagaaattc 360aatgaactgc gcggyaagtt ccaaaacctg caattagcgg ttaatgaatt tggtcgtgac 420agtmaycaag cwtctgaagc ktcarrcytr gtrytggata tyttccgyga attccgycta 480acaccaaarc aattygacca yttggttgaa actctgcgya cytcratgga tcgtgttcgy 540acccaagarc gyttggtrat gaaagcvgtr gttgaagtcg 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tyttccgcga attccgccta 480acaccaaaac aatttgacca tttggttgaa actctgcgta cctcgatgga tcgtgttcgt 540acccaagagc gyttggtgat gaaagcvgtg gttgaagtcg cgaaaatgcc aaagaaatca 600tttattgcyc trtttacagg caatgaatcg aatgargaat ggctygataa agtrctcgct 660tctgataarc cttatgtaca aaaagtacgt gagcaagaag acgatattcg ccgctcaatc 720caaaaactkc agatgatcga acargagact tcactgtctg ttgagcgtat caaagacatc 780agccgtcgta tgtctatcgg tgaagcgaaa gctcgccgtg cg 822权利要求1.一种如SEQ ID NO1所示基因的片段，它是编码序列表中SEQID NO1的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)片段，并包含第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位(也称作核苷酸数)中的任意一个或多个核苷酸，上述位点对霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和最小弧菌(Vibrio mimicus)细菌类群是特异的，其中，所述基因片段可用于设计特异性基因扩增引物或探针。2.一种基因扩增引物，它所含的链或其互补链含有15个或以上连续的核苷酸，其中一个或多个核苷酸位于编码含有权利要求1片段的序列表中SEQ ID NO1的DNA促旋酶β亚单位的基因(gyrB)的第21、96、107、126、153、190、258、270、279、285、357、543、552、557、600、690、702、714、729、733、734、759、771、782、786、792、795、或885位中的任意位点，上述位点对霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群是特异的。3.根据权利要求2所述的基因扩增引物，其中使用高频含有权利要求1所列霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的两个或多个位点的区域。4.根据权利要求2所述的基因扩增引物，其中3’末端的核苷酸是位于权利要求1所列霍乱弧菌和最小弧菌细菌类群特异的位点上的核苷酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：小泉雄史，西山叶子，山本敏，福山正文，古畑胜则，大仲贤二，
申请(专利权)人：株式会社日冷食品，
类型：发明
国别省市：
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